Investigación en bioquímica molecular y proteómica 2008
Por cuarto año consecutivo, los alumnos del último año de la especialidad química de la Escuela Tecnico ORT Argentina realizarán sus proyectos finales en distintas universidades y centros de investigación, con profesionales reconocidos. La metodología de trabajo evita la transposición didáctica, permitiendo a los estudiantes, realizar su actividad final en los lugares donde se está generando el conocimiento.
La articulcion entre el nivel medio y el posgrado universitario es auspiciada por el CONICET (consejo nacional de investigacion cientifica y tecnica). Los proyectos de investigacion para el año en curso son:
1) Evaluación de la expresión de la molecula de adhesión cadherina epitelial en tejidos humanos normales y tumorales.
Investigador: Dra. Monica Vazquez-Levin.Instituto de biología y medicina molecular ( IBYME-CONICET) .
Alumnos: Yael Dobzewicz y Gala Szapiro.
Blog: http://www.proyecto-6q.blogspot.com/
2) Accion del hexaclorobenceno (HCB) sobre la Uroporfirinógeno descarboxilasa de una línea celular de hepatocitos humanos. Mecanismo de acción .
Investigador: Dra. Maria del Carmen Rios de Molina.
Instituto: Departamento química biológica, facultad de ciencias exactas y naturales.
Alumnos: Lucas Toiw y Uriel Frid.
Blog: http://www.proyectofrid-toiw08.blogspot.com/
3) Modelos experimentales de enfermedades metabólicas: Porfiria y Síndrome Metabólico. Proteómica y Metabolómica de estos disturbios.
Investigador: Dra. Marta Blanca Mazzetti.
Instituto: Departamento de Química Biológica, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA). Alumnos: Maria Duperron y Mauro Elencwajg.
Blog: http://www.proyectofinal6q.blogspot.com/
4) Factores no hemodinámicos relacionados con la génesis y evolución de la proteinuria durante la enfermedad renal progresiva.
Investigador: Dra. Elsa Zotta.
Instituto: Laboratorio de Fisiopatogénia, Departamento de fisiología, Facultad de medicina, UBA.
Alumnos: Barbara Helueni y Melanie Naiman.
Blog: http://www.proyectoq08.blogpsot.com/
5) Estudio de la participacion de la anandamida en la regulacion de la interaccion espermatozoide-ovioducto en un modelo bovino.
Investigador: Dra. Silvina Perez Martinez.
Instituto: Facultad de medicina - UBA.Alumnos: Judith Arenas Tenenbaum y Melina Braverman.
Blog: http://www.scienceproject08.blogspot.com/
6) El estudio de los mecanismos moleculares involucrados en la regulación del gen UGA4 de Saccharomyces cervisiae en respuesta a cambios en la disponibilidad de nutrientes con el fin de dilucidar las distintas cascadas de señales desencadenadas por dichos nutrientes y establecer sus interconexiones.
Investigador: Dra Susana Correa García.
Instituto: Departamento de Química Biologica, Facultad de ciencias Exactas y Naturales, UBA. Alumnos: Iván Mikiej y Victoria Salama.
Blog: http://www.proyectoquimica22.blogspot.com/
7) Diagnóstico de la enfermedad de Von Willebrand (VWD) tipo 2N por técnicas fenotípicas y genotípicas.Investigador: Dra. Adriana I. Woods.
Instituto: Instituto de Investigaciones Hematológicas "Mariano R. Castex" de la Academia Nacional de Medicina.
Alumnos: Abigail Skverer y Daniela Lin.
Blog: http://www.vwd-diagnostico.blogspot.com/
8) Estudio de la mielinogenesis en el sistema nervioso periferico en condiciones fisiologicas y patologicas. Participacion de celulas pluripotentes en el proceso de degeneracion-regeneracion nerviosa.
Investigador: Dra Patricia Setton-Avruj.
Instituto: Departamento de Quimica Biologica, Facultad de Farmacia y Bioquimica (IQUIFIB-UBA-CONICET).
Alumnos: Daniel Averbuj y Eitan Rozenszajn.
Blog: http://www.proyectoaverbuj-rozenszajn.blogspot.com/
9) Diseño y desarrollo de vacunas antitumorales empleando bacterias y celulas tumorales modificadas con genes inmunomodiladores. Estudio de los mecanismos inmunes inducidos. Investigador: Claudia I. Waldner y Claudia Mongini.
Instituto: Laboratorio de inmunologia celular y molecular. Centro de Estudios Farmacologicos y Botanicos (CEFYBO. CONICET-UBA)
Alumnos: Amalia Surijon y Maria Belen Tolava Rivero.
Blog: http://www.amibeluproyecto.blogspot.com/
10) Marcadores Geneticos Asociados al Cáncer.
Investigador: Dr.Javier Hernán Cotignola.
Instituto: Laboratorio de Cáncer y Apoptosis del Departamento de Quimica Biologica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales de la UBA.
Alumnos: Ayelén Marano y Solange Perchik.
Blog: http://www.marcadoresgeneticos.blogspot.com/
11) Expresion del canal de la conductancia transmembranal de la Fibrosis Quistica (CFTR) en placentas Preeclampticas: posible rol en la regulacion de la actividad de la Acuoporina-9 (AQP9).
Investigador: Dr Alicia E Damiano.
Instituto: Catedra de Biologia Celular, Departamento de Ciencias Biologicas, Facultad de Farmacia y Bioquimica (UBA)
Alumnos: Gabriel Colodenco y Martín Sapir.
Blog: http://www.proyectofinalcs.blogspot.com/
12) Proteómica de factores secretados por células de cáncer de mama y mama normal con capacidad inhibitoria de la producción lipídica.
Investigador: Dra.Guerra de Grignoli Liliana Noemi.
Instituto: Departamento de Ciencias biologicas. Facultad de ciencias exactas y naturales, UBA-CONICET.
Alumnos: Fabiana Durante y Tamara Broitman.
Blog: http://tyf-proyecto08.blogspot.com/
13) Estudio de la Growth Associated Protein (GAP-43), su interacción con la Ubicutina y su participación en el control del ciclo celular en células NIH3T3 transfectadas en forma estable y transiente. Efecto de la Apo-transferrina en la remielización: participación de la vía Notch en la diferenciación oligodendrioglial.
Investigador: Dra Ana M. Adamo.
Instituto: Departamento de Química Biológica Patológica, Facultad de Farmacia y Bioquímica de la UBA. CONICET.
Alumnos: Rodrigo C. Pampin y Robby Mattes.
Blog: http://www.proyectodeatuyrobby.blogspot.com/
14)Neovascularizaciòn en un modelo murino de inflamaciòn aguda inducida por LPS.
Investigador:Eulalia de la Torre.
Instituto: Facultad de Medicina - Uba - Laboratorio de Inmunofarmacologia.
Alumnos: Federico Mauas Walach y Pablo Kuleff.
Blog: http://finalproyectort.blogspot.com/
15)Interacción de sumo-1 y mage-a2 en la regulacion del oncosupresor p53
Investigador: Martín Monte.
Instituto: Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA)
Alumnos: Leonel Stermann y Yair Litman.
Blog: http://proyectosumo.blogspot.com/
2 de octubre
Monitoreamos el crecimiento con calibre (como siempre) midiendo los tres diámetros. En este caso fue el grupo de ratones los cuales le inducimos el tumor. Solo pudimos notar micro puntos, se palpaba una bolita muy pequeña.
Terminamos de hacer las curvas de crecimiento tumoral e hicimos curvas de sobrevida (vivos en función de los días a partir de que el tumor fue inducido).
Terminamos de hacer las curvas de crecimiento tumoral e hicimos curvas de sobrevida (vivos en función de los días a partir de que el tumor fue inducido).
25 de septiembre
Monitoreamos el crecimiento del tumor en distintos grupos de ratones. El tamaño lo tomamos como el volumen (midiendo los tres diámetros: ancho, largo y profundidad). Las jaulas eran las B200 VT A: bacteria CVD intratumoral y periganglinar + CVD intranasal, B: bacteria TY intratumoral y periganglinar + TY intranasal, C: bacteria CVD intratumoral y periganglinar + PBS intranasal, D: bacteria TY intratumoral y periganglinar + PBS intranasal, E(control): PBS intranasal + PBS intratumoral y periganglinar; y el grupo 326 A: plasmido subcutaneo IL12 + IL15 50microg por animal + PBS intranasal, B: plasmido IL12 + IL15 50microg por animal intranasal + PBS subcutaneo, C: PBS intranasal + PBS subcutaneo. (Se puede hacer en todos los casos en vez de subcutaneo, de forma intratumoral).
Luego hicimos la curva de crecimiento tumoral, en cm3 en función de días (tomando el promedio de los volúmenes de todos los ratones en un día, como el volumen promedio en un día y tomando como primer día el día que fue inducido el tumor).
Luego hicimos la curva de crecimiento tumoral, en cm3 en función de días (tomando el promedio de los volúmenes de todos los ratones en un día, como el volumen promedio en un día y tomando como primer día el día que fue inducido el tumor).
18 de Septiembre
Hoy preparamos a las células LM3 para poder inocular.
Para esto realizamos los siguientes pasos:
1. Miramos a las células Lm3 por el microscopio (estas crecen en monocapa)
2. Lavamos dos veces con PBS para sacar el medio (que tiene células muertas y desperdicios)
3. Agregamos tripsina que tiene una enzima peptidasa (rompe la monocapa separando a las células LM3)
4.Se lleva a la estufa por 5´a 37ºC para que las enzimas se activen.
5. Mirar las LM3 por el microscopio, si no están separadas, golpear las paredes del envase suavemente.
6. Colocarlas en el medio MEM (2 % glutamina, 1% penincilina y estreptomisina, o.5 %gentamisina)
7.Centrifugamos 8´a 16ºC a 82G.
8. Luego de centrifugar tiramos el sobrenadante y volvemos a llenar con medio MEM.
9. Volvemos a centrifugar.
10. Tirar el sobrenadante y agregar 1 ml de medio MEM; tomamos una alícuota y contar la cantidad de células (previamente teñidas con trip-blue) por el microscopio.
11. Inoculas a cada ratón con 200 microlitros de las células en medio MEM, de forma subcutánea.
Para esto realizamos los siguientes pasos:
1. Miramos a las células Lm3 por el microscopio (estas crecen en monocapa)
2. Lavamos dos veces con PBS para sacar el medio (que tiene células muertas y desperdicios)
3. Agregamos tripsina que tiene una enzima peptidasa (rompe la monocapa separando a las células LM3)
4.Se lleva a la estufa por 5´a 37ºC para que las enzimas se activen.
5. Mirar las LM3 por el microscopio, si no están separadas, golpear las paredes del envase suavemente.
6. Colocarlas en el medio MEM (2 % glutamina, 1% penincilina y estreptomisina, o.5 %gentamisina)
7.Centrifugamos 8´a 16ºC a 82G.
8. Luego de centrifugar tiramos el sobrenadante y volvemos a llenar con medio MEM.
9. Volvemos a centrifugar.
10. Tirar el sobrenadante y agregar 1 ml de medio MEM; tomamos una alícuota y contar la cantidad de células (previamente teñidas con trip-blue) por el microscopio.
11. Inoculas a cada ratón con 200 microlitros de las células en medio MEM, de forma subcutánea.
4 de Septiembre
Hicimos un repaso sobre las líneas LBC y la LM3 hasta llegar al ratón. El LBC crece en suspension, por lo que se debe centrifugar para que las células queden abajo. Tiramos el medio, y volvemos a centrifuga (hasta que queden solo las celulas) se lava con PBS; luego de esto esta listo para inocular directamente (medir la concentracion).
La línea LM3 crece en monocapa y luego se le debe poner tripsina ya que rompe el enlace de células y levanta la monocapa, dejándolas en suspension. Pero como las proteínas del suero que tiene el medio donde esta la LM3 la inactiva, se debe lavar el suero. Luego se procede de la misma manera que con la línea LBC y se inocula en ratones singenéicos de la cepa BALB/c.
También repasamos la respuesta inmunologica de histocompatibilidad y sobre los tipos de linfocitos, que son células presentadoras de antígenos lo que ayuda a desarrollar una respuesta. Pueden ser linfocitos T"helpers"1, donde se encuentras los linfocitos T citotóxicos, que pueden ser coestimuladores (que la falta de una proteína los estimule), eliminan células con afecciones en su interior; y pueden ser linfocitos Th2 que estimulan a los linfocitos B, que son anticuerpos que eliminan patógenos en sangre.
Luego aprendimos sobre las citoquinas, que tienen que estar en cierto balance en el cuerpo, ya que inhiben respuestas inmunológicas.
Por último, hablamos de los plásmidos como tratamiento a tumores. Estos tienen un injerto y un promotor (CMV) para que se replique, lo que hace que cuando lo inoculemos, la célula lo incorpore en el núcleo y por compatibilidad de bases se unan, y una vez que la célula exprese la proteína libere la sintetizada.
Luego de todo esto, fuimos al bioterio (donde estan los ratones a experimentar).
Aprendimos como agarrarlos de manera de inmovilizarlos sin lastimarlos. Y, en grupos con tratamientos previos, aplicamos una tercera dosis de sustancias y controles. Como queremos que todos esten en iguales condiciones para un posterior analizamiento eficiente, se les debe poner a todos lo que pueda alterar la reaccion.
Los tres grupos que trataremos ya tienen el tumor inducido y crecido. Estan con células LM3. Utilizaremos en su tratamiento citoquinas PIL-12 y PIL-15 (en menos concentración en el caso de la inhalación). El primer grupo lo monitoreamos (medimos con calibre el tamaño del tumor para luego hacer una curva de crecimiento tumoral), le dimos plásmido internasal y PBS (placebo). El segundo grupo lo monitoreamos, le pusimos el plásmido intratumoral y PBS. Y al tercer grupo solo PBS.
La línea LM3 crece en monocapa y luego se le debe poner tripsina ya que rompe el enlace de células y levanta la monocapa, dejándolas en suspension. Pero como las proteínas del suero que tiene el medio donde esta la LM3 la inactiva, se debe lavar el suero. Luego se procede de la misma manera que con la línea LBC y se inocula en ratones singenéicos de la cepa BALB/c.
También repasamos la respuesta inmunologica de histocompatibilidad y sobre los tipos de linfocitos, que son células presentadoras de antígenos lo que ayuda a desarrollar una respuesta. Pueden ser linfocitos T"helpers"1, donde se encuentras los linfocitos T citotóxicos, que pueden ser coestimuladores (que la falta de una proteína los estimule), eliminan células con afecciones en su interior; y pueden ser linfocitos Th2 que estimulan a los linfocitos B, que son anticuerpos que eliminan patógenos en sangre.
Luego aprendimos sobre las citoquinas, que tienen que estar en cierto balance en el cuerpo, ya que inhiben respuestas inmunológicas.
Por último, hablamos de los plásmidos como tratamiento a tumores. Estos tienen un injerto y un promotor (CMV) para que se replique, lo que hace que cuando lo inoculemos, la célula lo incorpore en el núcleo y por compatibilidad de bases se unan, y una vez que la célula exprese la proteína libere la sintetizada.
Luego de todo esto, fuimos al bioterio (donde estan los ratones a experimentar).
Aprendimos como agarrarlos de manera de inmovilizarlos sin lastimarlos. Y, en grupos con tratamientos previos, aplicamos una tercera dosis de sustancias y controles. Como queremos que todos esten en iguales condiciones para un posterior analizamiento eficiente, se les debe poner a todos lo que pueda alterar la reaccion.
Los tres grupos que trataremos ya tienen el tumor inducido y crecido. Estan con células LM3. Utilizaremos en su tratamiento citoquinas PIL-12 y PIL-15 (en menos concentración en el caso de la inhalación). El primer grupo lo monitoreamos (medimos con calibre el tamaño del tumor para luego hacer una curva de crecimiento tumoral), le dimos plásmido internasal y PBS (placebo). El segundo grupo lo monitoreamos, le pusimos el plásmido intratumoral y PBS. Y al tercer grupo solo PBS.
14 de agosto
Continuamos con el protocolo para la purificacion de plasmidos. (solo para CD40)
Resuspendemos las bacterias con el buffer P1 (con RNAsa). Luego le aplicamos el buffers P2 y mezclamos cuidadosamente, esperamos 5 minutos y ponemos el siguiente buffer(P3). Lo dejamos reposar por 20 minutos en frio.
Después lo centrifugamos por 30 minutos a 4ºC. Removemos el sobrenadante y lo ponemos en un recipiente nuevo y centrifugamos por 15 minutos a la misma temperatura.
Mientras tanto limpiamos la columna con el buffer renew y la equilibramos con el buffer QBT. colocamos el sobrenadante en la columna y lo dejamos correr. Después de vaciarse la columna agregamos el buffer QC y por ultimo el buffer QF, este arrastra el plasmido por ende lo guardamos.
Para precipitar el DNA lo diluimos en isopropanol y centrifugamos. Dejamos decantar y lavamos el pellet con etanol 70%. Guardamos el DNA en el freezer para poder continuar en la próxima clase.
Resuspendemos las bacterias con el buffer P1 (con RNAsa). Luego le aplicamos el buffers P2 y mezclamos cuidadosamente, esperamos 5 minutos y ponemos el siguiente buffer(P3). Lo dejamos reposar por 20 minutos en frio.
Después lo centrifugamos por 30 minutos a 4ºC. Removemos el sobrenadante y lo ponemos en un recipiente nuevo y centrifugamos por 15 minutos a la misma temperatura.
Mientras tanto limpiamos la columna con el buffer renew y la equilibramos con el buffer QBT. colocamos el sobrenadante en la columna y lo dejamos correr. Después de vaciarse la columna agregamos el buffer QC y por ultimo el buffer QF, este arrastra el plasmido por ende lo guardamos.
Para precipitar el DNA lo diluimos en isopropanol y centrifugamos. Dejamos decantar y lavamos el pellet con etanol 70%. Guardamos el DNA en el freezer para poder continuar en la próxima clase.
17 Julio
Comenzamos nuevamente el protocolo, pero con CD40, ya que como se puede apreciar en la foto del 10 de Julio, en el corrimiento de ADN no figuro, por ende, perdimos el ADN en algún paso del protocolo, y hay que realizarlo nuevamente.
Centrifugamos las bacterias y las guardamos en el freezer hasta su próximo uso.
Centrifugamos las bacterias y las guardamos en el freezer hasta su próximo uso.
10 de Julio
Continuamos con el ultimo paso de este protocolo, que es cuantificar el análisis en el gel agarosa.
Pero para esto se deben hacer previamente diluciones del DNA resultante tanto de CD40 como de CD80 (aunque en CD40 no fueron los resultados esperados, se debe hacer igual para descartar alguna posibilidad de que haya ADN). El corrimiento de ADN sirve para comparar el ADN nuestro con un Marker, y según su corrimiento y donde coincida, se saca la concentración. Además se puede comprobar que no haya ARN o alguna otra sustancia que no se quiera, en otras palabras, es una forma de verificar si hicimos bien el protocolo y el ADN esta puro.
Las diluciones fueron las siguientes, mediante cálculos que dependian de la concentración de ADN de CD40 y CD80, pusimos las correctas cantidades de enzima digestiva y Tris-Cl. Centrifugamos y templamos donde pusimos enzima digestiva.
Nos quedaron un total de 5 ependorf:
1)Tris-Cl+CD80
2)Enzima digestiva+Tris-Cl+CD80
3)Marker (el corrimiento "guia" para comparar)+Tris-Cl
4)CD40+Tris-Cl
5)Enzima digestiva+CD40+Tris-Cl
Luego procedimos a hacer el corrimiento de ADN, con mucho cuidado (guantes, como toda la experiencia), pero especial cuidado aquí de no tocar nada porque el bromuro de etilo es cancerigeno. Inoculamos el ADN en el gel y esperamos dos horas a que se corra (recordar que el Gel estaba ya solidificado de la clase anterior). Luego de este tiempo, pudimos observar el corrimiento, consiste en que el DNA al ser negativo, vaya al polo positivo. Y le sacamos una foto que luego usaremos para averiguar la concentración, comparando como dijimos antes, con el Marker.
Pero para esto se deben hacer previamente diluciones del DNA resultante tanto de CD40 como de CD80 (aunque en CD40 no fueron los resultados esperados, se debe hacer igual para descartar alguna posibilidad de que haya ADN). El corrimiento de ADN sirve para comparar el ADN nuestro con un Marker, y según su corrimiento y donde coincida, se saca la concentración. Además se puede comprobar que no haya ARN o alguna otra sustancia que no se quiera, en otras palabras, es una forma de verificar si hicimos bien el protocolo y el ADN esta puro.
Las diluciones fueron las siguientes, mediante cálculos que dependian de la concentración de ADN de CD40 y CD80, pusimos las correctas cantidades de enzima digestiva y Tris-Cl. Centrifugamos y templamos donde pusimos enzima digestiva.
Nos quedaron un total de 5 ependorf:
1)Tris-Cl+CD80
2)Enzima digestiva+Tris-Cl+CD80
3)Marker (el corrimiento "guia" para comparar)+Tris-Cl
4)CD40+Tris-Cl
5)Enzima digestiva+CD40+Tris-Cl
Luego procedimos a hacer el corrimiento de ADN, con mucho cuidado (guantes, como toda la experiencia), pero especial cuidado aquí de no tocar nada porque el bromuro de etilo es cancerigeno. Inoculamos el ADN en el gel y esperamos dos horas a que se corra (recordar que el Gel estaba ya solidificado de la clase anterior). Luego de este tiempo, pudimos observar el corrimiento, consiste en que el DNA al ser negativo, vaya al polo positivo. Y le sacamos una foto que luego usaremos para averiguar la concentración, comparando como dijimos antes, con el Marker.
3 de Julio
Sacamos el DNA del freezer y quitamos el sobrenadante rápidamente, para que el DNA no se pierda. (Esta casi invisible)
Disolvimos el DNA en un adecuado volumen de buffer Tris-Cl. Luego, para determinar el rendimiento y la concentración den DNA usamos el espectofotometro UV.
Hicimos cálculos para saber cuanto teníamos de cada uno, tanto en la CD80 como en la CD40, lamentablemente en esta ultima el resultado no fue lo esperado y casi no se detecto ADN (lo habremos perdido en alguno de los pasos anteriores al protocolo).
Por ultimo, hicimos el gel agarosa para el corrimiento de ADN con mucho cuidado, ya que los materiales que se utilizan para este procedimiento son cancerosos. Y lo continuaremos la clase siguiente.
Disolvimos el DNA en un adecuado volumen de buffer Tris-Cl. Luego, para determinar el rendimiento y la concentración den DNA usamos el espectofotometro UV.
Hicimos cálculos para saber cuanto teníamos de cada uno, tanto en la CD80 como en la CD40, lamentablemente en esta ultima el resultado no fue lo esperado y casi no se detecto ADN (lo habremos perdido en alguno de los pasos anteriores al protocolo).
Por ultimo, hicimos el gel agarosa para el corrimiento de ADN con mucho cuidado, ya que los materiales que se utilizan para este procedimiento son cancerosos. Y lo continuaremos la clase siguiente.
26 de junio
Hoy continuamos con el protocolo para la purificacion de plasmidos.
Resuspendimos el pellet en un buffer adecuado (P1) con la RNAsa, después agregamos otro bufferP2 y lo mezclamos. Por ultimo, después de esperar 5 minuto, agregamos el ultimo buffer P3 y esperamos 20 minutos en frió. (el buffer P1 "saca" al ARN, el buffer P2 destruye la membrna de las bacterias, por esto no es comveniente que pase los cinco minutos porque puede destruir al plasmido).
Después lo centrifugamos (30 minutos a 4ºC) y removemos el sobrenadante(que es el plasmido). Repetimos la centrifugación pero por 15 minutos.
Limpiamos la columnas que vamos a usar con el buffer renew y las equilibramos con el buffer QBT. Colocamos el sobrenadanten la columna y luego de vaciarse, quedan plasmidos, proteinas y otros materiales.
Limpiamos los restos de proteínas con buffer QC, para dejar el plasmido en la columna y luego le ponemos el buffer QF, que arrastra al plamisdo, el cual se guarda en un recipiente.
Resuspendimos el pellet en un buffer adecuado (P1) con la RNAsa, después agregamos otro bufferP2 y lo mezclamos. Por ultimo, después de esperar 5 minuto, agregamos el ultimo buffer P3 y esperamos 20 minutos en frió. (el buffer P1 "saca" al ARN, el buffer P2 destruye la membrna de las bacterias, por esto no es comveniente que pase los cinco minutos porque puede destruir al plasmido).
Después lo centrifugamos (30 minutos a 4ºC) y removemos el sobrenadante(que es el plasmido). Repetimos la centrifugación pero por 15 minutos.
Limpiamos la columnas que vamos a usar con el buffer renew y las equilibramos con el buffer QBT. Colocamos el sobrenadanten la columna y luego de vaciarse, quedan plasmidos, proteinas y otros materiales.
Limpiamos los restos de proteínas con buffer QC, para dejar el plasmido en la columna y luego le ponemos el buffer QF, que arrastra al plamisdo, el cual se guarda en un recipiente.
Para precipitar el DNA lo diluimos en isopropanol, mezclamos y centrifugamos inmediatamente por 30 min. a 4 grados. Y dejamos decantar cuidadosamente.
Luego lavamos el pellet con etanol 70% templado, y lo dejamos decantar. Guardamos el DNA en el freezer y continuamos en la próxima clase.
19 de junio
Hoy comenzamos el protocolo para purificación de plasmidos.
Partiendo de una sola colonia, la incubamos en el medio LB (con antibióticos) durante 8 horas a 37ºC . Para seguir multiplicando las colonias, y poder tener una mayor copia de plasmidos, realizamos una dilución 1/1000 y lo inoculamos en 100ml del medio( a 37ºC durante 12-16 horas con agitación vigorosa).
Después lo centifugamos en a 6000 rpm por 15 minutos por 4 ºC, luego de esta centrifugación las bacterias se quedaron abajo, entonces procedemos a quitar el medio de cultivo. En este paso nos detuvimos ya que podemos congelar las células, sin ningún problema, (a -20ºC) y continuar la semana siguiente.
Partiendo de una sola colonia, la incubamos en el medio LB (con antibióticos) durante 8 horas a 37ºC . Para seguir multiplicando las colonias, y poder tener una mayor copia de plasmidos, realizamos una dilución 1/1000 y lo inoculamos en 100ml del medio( a 37ºC durante 12-16 horas con agitación vigorosa).
Después lo centifugamos en a 6000 rpm por 15 minutos por 4 ºC, luego de esta centrifugación las bacterias se quedaron abajo, entonces procedemos a quitar el medio de cultivo. En este paso nos detuvimos ya que podemos congelar las células, sin ningún problema, (a -20ºC) y continuar la semana siguiente.
12 de Junio
Hoy ajustamos el PH en las soluciones buffer que vamos a utilizar para nuestros experimentos.
Estas son Buffer QBT, Buffer P1, Buffer QC, Buffer QF , Buffer P3 y BufferP2. Las controlamos mediante un peachimetro que media el PH en cada solución buffer.
En el caso de que tuviera un PH mas alcalino de lo debido, se colocaba HCL para bajar el PH; y, en el caso de que tuviera un PH mas ácido de lo debido, se colocaba NAOH para subir el PH. La considerabamos ajustada a su PH cuando tenia el mínimo o nada de error en su medición buffer.
Luego llevamos los envases al autoclave para esterilizar.
5 de Junio
Aprendimos como replicar el ADN. Esto sirve para evaluar la habilidad de una misma colonia para crecer bajo diferentes condiciones. Estas son transferidas de una placa a otra para mantener las células originales. El plásmido que vamos a utilizar es ampicilina resistente, de manera que le colocaremos este antibiótico para eliminar las bacterias que son sensibles a este y, de esta manera, aislar el plásmido a utilizar.
Hicimos el caldo enriquecido LB, el cual vamos a utilizar para el cultivo de nuestras bacterias.
Este, contiene triptona, extracto de levadura y Cloruro de Sodio.
Para esterilizar tapamos la boca con un tapon de algodon y aluminio. Y, junto con cajas de tips (envueltas en aluminio y papel madera), los llevamos al autoclave.
Hicimos el caldo enriquecido LB, el cual vamos a utilizar para el cultivo de nuestras bacterias.
Este, contiene triptona, extracto de levadura y Cloruro de Sodio.
Para esterilizar tapamos la boca con un tapon de algodon y aluminio. Y, junto con cajas de tips (envueltas en aluminio y papel madera), los llevamos al autoclave.
29 de Mayo
Analizamos como se procesan los datos estadísticos en la curva de muerte. A partir de un dato control se utilizan distintos métodos experimentales para revertir el cancer y se evalúa la evolución en dicho gráfico (cuál es la más efectiva, la que detiene o disminuye la muerte de ratones, por ende la mas propicia para seguir estudiándola. Siempre probado con un número mínimo de ratones).
También presenciamos una cirugía para inyectarle células de tumor LM3 al ratón: la veterinaria lo anestesió, le sacó el bazo y se inyectó en la arteria las células para que haga directamente metástasis y se desarrolle el tumor en el hígado. Luego de esperar tres minutos, se extirpa el bazo y se cose con hilo de sutura desinfectando con Pervinox.
Por último hablamos de los tumores, que se considera cualquier alteración en los tejidos que produzca un aumento de volumen anormal, haciéndolo parecer hinchado o distendido. En otras palabras, cualquier bulto que se deba a un aumento en el número de células de forma incontrolada que lo componen.
Hay dos formas de tumores generales: los benignos y los malignos.
Los tumores benignos o neoplasias tiene células que se asemejan a las células originales y permanecen juntas y a menudo son rodeadas por una membrana de contención o cápsula. Tienen un crecimiento lento que puede interrumpirse o retroceder y no produce metástasis. Por lo general no ocasiona la muerte y no es cancerosa, pueden removerse o extirparse y no tienden a reaparecer.
Los tumores malignos tienen células capaces de crecer rápidamente, de manera descontrolada, ininterrumpible e independiente del tejido donde comenzó, y no retrocede. Además son capaces invadir o infiltrar, destruir, reemplazar y hacer metástasis a lugares distantes del tumor primario, dañando tejidos y órganos cercanos al tumor. Se consideran células cancerosas, no se asemejan a las células maduras originales y pueden ocasionar la muerte si no se diagnostica y suministra tratamiento.
22 de Mayo
Palpamos los dos tipos de tumores(LBC y LM3) en ratones BALB/c. Aprendimos la forma en que se tratan con diferentes tipos de inmunoterapias.
Estudiamos la curva de muerte, que monitorea la evolución del tumor a través del fallecimientos de los ratones por día, entre el grupo de control (tienen el tumor) y el experimental (tienen el tumor y están en tratamiento).
Nos explicaron de donde se obtienen los tumores LM3 y LBC. Estos provienen un cultivo primario que se expandió in vitro, para tener una linea de estos.
Se inoculan los ratones de manera intraperitonial (atravesando en peritoneo), subcutánea (más superficial) e intravenosa.
Nos anticiparon el tiempo de latencia (cuanto demora un tumor en ser palpable) y de vida estimados (cuanto resiste un ratón al tumor)
Por último vimos a las células del tumor LBC en microscopio óptico.
En esta foto se puede obsevar ascitis (acumulacion de liquido en el abdomen) provocado por el tumor LBC.
Esta foto muestra el tumor LM3.
Estudiamos la curva de muerte, que monitorea la evolución del tumor a través del fallecimientos de los ratones por día, entre el grupo de control (tienen el tumor) y el experimental (tienen el tumor y están en tratamiento).
Nos explicaron de donde se obtienen los tumores LM3 y LBC. Estos provienen un cultivo primario que se expandió in vitro, para tener una linea de estos.
Se inoculan los ratones de manera intraperitonial (atravesando en peritoneo), subcutánea (más superficial) e intravenosa.
Nos anticiparon el tiempo de latencia (cuanto demora un tumor en ser palpable) y de vida estimados (cuanto resiste un ratón al tumor)
Por último vimos a las células del tumor LBC en microscopio óptico.
En esta foto se puede obsevar ascitis (acumulacion de liquido en el abdomen) provocado por el tumor LBC.
Esta foto muestra el tumor LM3.
15 de mayo
Nos mostraron las instalaciones en donde vamos a trabajar y algunos de los elementos de trabajo.
Tuvimos una clase teórica sobre el sistema inmunologico,conjunto de mecanismos que protegen al organismo de infecciones por medio de la identificación y eliminación de agentes patógenos al huésped: como bacterias, virus y tumores.
Como reacciona este: puede ser en forma espontánea e innata, como barreras físicas que evitan que los agentes patógenos como las bacterias y los virus penetren en el organismo. Esto es inmediato pero no especifico. Y el adaptativo, adapta su respuesta durante la infección para mejorar el reconocimiento del agente patógeno; también produce una respuesta inducida, que la provee las vacunas, el suero.
La mayor parte del sistema inmunologico esta formado por glóbulos blancos, que actúan como organismos unicelulares independientes. Estos contienen: fagocitos (macrófagos, neutrófilos y células dendríticas), mastocitos,linfocitos, eosinófilos, basófilos y células asesinas naturales.
El mecanismo de destrucción empieza por atacar a el antígeno con neutrófilos, que degradan y liberan sustancias que llaman a las otras células de los glóbulos blancos. En conjunto se encargan de fagocitar (comen, desarman y presentan la proteína en la membrana de la célula invadida).Los linfocitos B sintetizan los anticuerpos y se desencadena una serie de mecanismos que hace que la bacteria se destruya. Los linfocitos T colaboran sintetizando citoquinas, ayudando a la especificidad de los anticuerpos. Y los citotóxicos reconocen las células presentadoras de antígenos.
Los tumores que vamos a ver son el linfoma LBC y el carcinoma de mama, LM3. En esta clase nos enfocamos en el estudio del linfoma LBC que se induce en ratones de la cepa BALB/c; y los pasos a seguir para innocularles el tumor y probar diferentes tratamientos, para evauluar las respuestas de estos a ellos.
Tuvimos una clase teórica sobre el sistema inmunologico,conjunto de mecanismos que protegen al organismo de infecciones por medio de la identificación y eliminación de agentes patógenos al huésped: como bacterias, virus y tumores.
Como reacciona este: puede ser en forma espontánea e innata, como barreras físicas que evitan que los agentes patógenos como las bacterias y los virus penetren en el organismo. Esto es inmediato pero no especifico. Y el adaptativo, adapta su respuesta durante la infección para mejorar el reconocimiento del agente patógeno; también produce una respuesta inducida, que la provee las vacunas, el suero.
La mayor parte del sistema inmunologico esta formado por glóbulos blancos, que actúan como organismos unicelulares independientes. Estos contienen: fagocitos (macrófagos, neutrófilos y células dendríticas), mastocitos,linfocitos, eosinófilos, basófilos y células asesinas naturales.
El mecanismo de destrucción empieza por atacar a el antígeno con neutrófilos, que degradan y liberan sustancias que llaman a las otras células de los glóbulos blancos. En conjunto se encargan de fagocitar (comen, desarman y presentan la proteína en la membrana de la célula invadida).Los linfocitos B sintetizan los anticuerpos y se desencadena una serie de mecanismos que hace que la bacteria se destruya. Los linfocitos T colaboran sintetizando citoquinas, ayudando a la especificidad de los anticuerpos. Y los citotóxicos reconocen las células presentadoras de antígenos.
Los tumores que vamos a ver son el linfoma LBC y el carcinoma de mama, LM3. En esta clase nos enfocamos en el estudio del linfoma LBC que se induce en ratones de la cepa BALB/c; y los pasos a seguir para innocularles el tumor y probar diferentes tratamientos, para evauluar las respuestas de estos a ellos.
Curriculum Vitae
Nombre y apellido: Claudia Mongini
LUGAR Y FECHA DE NACIMIENTO: Buenos Aires, 16/051961
D.N.I.: 14.433.903
ESTUDIOS UNIVERSITARIOS
Titulos Obtenidos:
Bioquímica, egresada de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la UBA, 1985. Farmacéutica, egresada de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la UBA, 1987.
Doctora de la Universidad de Buenos Aires, 1994. Calificación: sobresaliente (10).
Cargo y función actual:
INVESTIGADOR ADJUNTO DEL CONICET.
DIRECTORA DEL LABORATORIO DE INMUNOLOGÍA MOLECULAR DEL CEFYBO
.
PREMIOS Y DISTINCIONES
Premio "Bernardo Houssay". Otorgado por la Sociedad Argentina de Biología. Título del trabajo: "Rechazo de un linfoma murino T por transferencia genética con las moléculas CD40, CD80 CD40L". Noviembre de 2004.
Premio "Florentino I. Fiorini". Otorgado por la Liga Argentina de Lucha Contra el Cáncer (LALCEC). Título del trabajo: "Estudio de la respuesta inmune anti-tumoral y de factores séricos que pueden influir en el crecimiento de un tumor". Septiembre de 1989.
Premio a la producción científica y tecnológica, otorgado por la Facultad de Farmacia y Bioquímica (UBA.), según resolución n°:4.676/93/94. Diciembre de 1993-94.
Premio "Florentino I. Fiorini". Otorgado por la Liga Argentina de Lucha Contra el Cáncer (LALCEC). Título del trabajo: "Inducción de mecanismos inmunes que limitan el desarrollo tumoral”. Noviembre de 1995.
Premio a la producción científica y tecnológica, otorgado por la Facultad de Farmacia y Bioquímica (UBA.), según resolución n°:4.676/95. Diciembre de 1995.
Premio Jornadas Científicas 1997 otorgado por la Academia Nacional de Farmacia y Bioquímica. Título del trabajo: “Nested PCR para la detección de isoformas de la molécula de adhesión CD44”. Agosto de 1998.
NÚMERO TOTAL DE PUBLICACIONES CON REFERATO EN REVISTAS NACIONALES: 3
NÚMERO TOTAL DE PUBLICACIONES CON REFERATO EN REVISTAS EXTRANJERAS: 22
Publicaciones (últimos años)
.
Splice variant expression of CD44 in patients with breast and ovarian cancer. Sanchez Lockhart M, Hajos SE, Basilio FM, Mongini C, Alvarez E. Oncology Report;8 (1): 145-51. (2001).
Induction of apoptosis in murine lymphoma cells by cyclosporin A. Mongini C, Waldner C, Calda Lopes E, Gravisaco MJ, Sánchez Lockhart M, Alvarez E & Hajos S. Int J Mol Med. 7:431-7 (2001).
Characterization of the Immunophenotype and the metastatic properties of a murine T- lymphoma cell line. Unexpected Co-Expression of CD4, CD3 and TCRβin T- Lymphoma Cells. Mongini C, Ruybal P, Gravisaco MJ, Croci M, Sánchez Lockhart M, Fabris V and Waldner C. In vitro Cell. Dev. Biol. 37 (9) 37. 499-504 (2001).
BHV-1 DNA vaccination: effect of the adjuvant RN-205 on the modulation of the immune response in mice. Zamorano, O. Taboga, M. Domínguez, A. Romera, M. Puntel, C. Tami, C. Mongini, C. Waldner, E. Palma and A. Sadir Vaccine: 20, 2656-2664 (2002).
RANKL expression in a case of follicular lymphoma. Barcala V, Ruybal P, García Rivello H, Waldner C, Ascione A, Mongini C. Eur J Hematol. 70: 417-419 (2003).
IL-2, IL-10, IL-15 and TNF are key regulators of a murine T-cell lymphoma growth. M J Gravisaco, C Mongini, E Alvarez, P Ruybal, A Escalada, M Sanchez-Lockhart, S Hajos and C Waldner International Journal of Molecular Medicine 12: 627-32 (2003).
Transgene expression enhancement in T-lymphoma cell lines. Ruybal P, Gravisaco MJ, Barcala V, Escalada , Cremaschi G, Taboga O, Waldner C, Mongini C. International Journal of Immunopharmacology. 5:1685-92 (2005).
Complete rejection of a T-cell lymphoma due to synergism of T-cell receptor costimulatory molecules, CD80, CD40L, and CD40. Ruybal P, Gravisaco MJ, Barcala V, Escalada A, Di Sciullo P, Waldner C, Mongini C. Vaccine 26:697-705; (2008).
LIBROS DETEXTO
C. Mongini, C. Waldner. Metodologías para la evaluación de las células inmunocompetentes. Capítulo 36. Inmunología e Inmunoquímica. 5º Edición. R. Margni y colaboradores. Editorial Panamericana. (1996).
ATCC: Métodos de Control de Calidad para Líneas Celulares. Participación en la traducción del libro ATCC Quality Control Methods for Cell Lines. Editorial Mapache. (1996).
formación de recursos humanos
Dirección de Técnicos Profesionales y no Profesionales, becarios, tesistas, pasantes, y estudiantes de las carreras de Bioquímica, Medicina y Ciencias Biológicas, como directora del Laboratorio de Inmunología Molecular del CEFYBO.
Formación de nuevos docentes, en los cursos dictados en la Cátedra de Inmunología de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la UBA, 1986/1997.
Dirección de auxiliares docentes, en ejercicio de la Jefatura de Trabajos Prácticos. Cátedra de Inmunología de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la UBA.
becarios otorgados por Instituciones académicas
Directora de Beca de Postgrado del CONICET de la médica Paula Di Sciullo. TÍTULO: ROL DE RANK- RANKL EN LA RESPUESTA INMUNE ANTI-TUMORAL. DISEÑO DE VACUNAS UTILIZANDO COMBINACIONES DE CÉLULAS TUMORALES. Desde abril de 2007.
Directora de Beca de Postgrado del CONICET de la licenciada Paula Ruybal. TÍTULO: Participación de las Moléculas Coestimuladoras en la Respuesta Inmune Anti-tumoral. Desde abril de 1998 hasta octubre de 2003.
dirección de tesis
Directora de la Tesis de Licenciatura de la estudiante de Ciencias Biológicas Paola De Luca. TÍTULO: Rol de RANK-RANKL, dos nuevas moléculas coestimuladoras del RcT, en la respuesta inmune antitumoral. En ejecución.
Directora de Tesis Doctoral de la licenciada Paula Ruybal. TÍTULO: Participación de las Moléculas Coestimuladoras en la Respuesta Inmune Anti-tumoral. Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad de Buenos Aires. Junio de 2004. Calificación: distinguido (9).
Co-Directora de la Tesis de Licenciatura de la estudiante de Ciencias Biológicas Paula Ruybal. TÍTULO: Apoptosis en Tejido Linfoide Asociado a Intestino. Una respuesta a la injuria o un Mecanismo Fisiológico. Noviembre de 1997. Calificación: 10.
subsidios recibidos en los últimos diez años
Integrante del grupo responsable del proyecto financiado por la ANPCyT (PICT 32404). Período 2007-2010. Tema: Desarrollo de vacunas antineoplásicas utilizando bacterias atenuadas como vectores de genes inmunomoduladores. Mecanismos inmunes responsables del efecto terapéutico antitumoral de una cepa genéticamente atenuada de Salmonella typhi.
Directora del Proyecto de Investigación Plurianual financiado por el CONICET (PIP 5330. Periodo: 2005-2006. Diseño y desarrollo de vacunas antitumorales empleando bacterias y células tumorales modificadas con genes inmunomoduladores. Estudio de los mecanismos inmunes inducidos.
Proyecto Estímulo a la Investigación (PEI 6331/01), del Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET). Tema: Estudio de diferentes mecanismos inmunes que participan en la modulación del crecimiento tumoral. Participación de las moléculas coestimuladoras del RcT en la respuesta inmune anti-tumoral.
Integrante del grupo responsable del proyecto financiado por la ANPCyT (PICT 05-10878/02). Período 2004-2006. Tema: Desarrollo de vacunas antineoplásicas utilizando bacterias atenuadas genéticamente como vectores para la transferencia in vivo de genes de citoquinas y moléculas coestimuladoras del RcT.
Co- Directora del Proyecto de Investigación Plurianual financiado por el CONICET (PIP 0229/00. Periodo: 2003-2004. Importancia de la transferencia de genes de citoquinas o de moléculas coestimuladoras del RcT en las células dencdríticas y tumorales para el desarrollo de vacunas contra el cáncer.
Directora del subsidio otorgado por The Third World Academy of Science. Tema: Regulation of apoptosis in leukemic cells by glucocorticoids and cytokines. Período 1999-2000.
Proyecto Estímulo a la Investigación (PEI 0186/98), del Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), período 1999. Tema: Participación de las moléculas coestimulatorias en la respuesta antitumoral.
Directora del subsidio otorgado por la Fundación Alberto J. Roëmmers para la Investigación clínica médica básica. Tema: Relación entre las moléculas de adhesión y la diseminación tumoral. Su importancia en la predicción de metástasis. Período 1995-1998.
Universidad de Buenos Aires, subsidio para asistir al IX Congreso Internacional de Inmunología realizado en San Francisco. Agosto de 1995.
Subsidio otorgado por la International Union of immunological Societies (IUIS) para presentar dos trabajos en el IX Congreso Internacional de Inmunología realizado en San Francisco (USA), entre el 23 y el 29 de Julio de 1995.
otros antecedentes
Comunicaciones Presentadas en Reuniones Científicas
Nacionales : 30
Internacionales : 26
ACTUACIÓN EN ORGANISMOS DE PLANEAMIENTO , PROMOCIÓN O EJECUCIÓN
Integrante del Banco de Evaluadores externos del British Journal of Hematology. Desde mayo de 2003.
Integrante del Banco de Evaluadores externos del Journal of Gene Medicine. Desde noviembre de 2004.
Integrante del Banco de Evaluadores de la Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica. Desde julio de 2002.
Integrante del Banco de Evaluadores del CONICET para evaluar becarios y proyectos de investigación. Desde enero de 1999.
Asociación Banco Argentino de Células (ABAC), miembro de la Comisión Directiva: Presidenta. Desde octubre de 2004.
Reconocimientos Científicos
Investigador invitado a presentar un trabajo en el 4th International Symposium on Predictive Oncology & Therapy. Impact of Biotechnology on cancer, prognosis, detection. Prevention. Niza, Francia. 24 -27 de Octubre de 1998
LUGAR Y FECHA DE NACIMIENTO: Buenos Aires, 16/051961
D.N.I.: 14.433.903
ESTUDIOS UNIVERSITARIOS
Titulos Obtenidos:
Bioquímica, egresada de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la UBA, 1985. Farmacéutica, egresada de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la UBA, 1987.
Doctora de la Universidad de Buenos Aires, 1994. Calificación: sobresaliente (10).
Cargo y función actual:
INVESTIGADOR ADJUNTO DEL CONICET.
DIRECTORA DEL LABORATORIO DE INMUNOLOGÍA MOLECULAR DEL CEFYBO
.
PREMIOS Y DISTINCIONES
Premio "Bernardo Houssay". Otorgado por la Sociedad Argentina de Biología. Título del trabajo: "Rechazo de un linfoma murino T por transferencia genética con las moléculas CD40, CD80 CD40L". Noviembre de 2004.
Premio "Florentino I. Fiorini". Otorgado por la Liga Argentina de Lucha Contra el Cáncer (LALCEC). Título del trabajo: "Estudio de la respuesta inmune anti-tumoral y de factores séricos que pueden influir en el crecimiento de un tumor". Septiembre de 1989.
Premio a la producción científica y tecnológica, otorgado por la Facultad de Farmacia y Bioquímica (UBA.), según resolución n°:4.676/93/94. Diciembre de 1993-94.
Premio "Florentino I. Fiorini". Otorgado por la Liga Argentina de Lucha Contra el Cáncer (LALCEC). Título del trabajo: "Inducción de mecanismos inmunes que limitan el desarrollo tumoral”. Noviembre de 1995.
Premio a la producción científica y tecnológica, otorgado por la Facultad de Farmacia y Bioquímica (UBA.), según resolución n°:4.676/95. Diciembre de 1995.
Premio Jornadas Científicas 1997 otorgado por la Academia Nacional de Farmacia y Bioquímica. Título del trabajo: “Nested PCR para la detección de isoformas de la molécula de adhesión CD44”. Agosto de 1998.
NÚMERO TOTAL DE PUBLICACIONES CON REFERATO EN REVISTAS NACIONALES: 3
NÚMERO TOTAL DE PUBLICACIONES CON REFERATO EN REVISTAS EXTRANJERAS: 22
Publicaciones (últimos años)
.
Splice variant expression of CD44 in patients with breast and ovarian cancer. Sanchez Lockhart M, Hajos SE, Basilio FM, Mongini C, Alvarez E. Oncology Report;8 (1): 145-51. (2001).
Induction of apoptosis in murine lymphoma cells by cyclosporin A. Mongini C, Waldner C, Calda Lopes E, Gravisaco MJ, Sánchez Lockhart M, Alvarez E & Hajos S. Int J Mol Med. 7:431-7 (2001).
Characterization of the Immunophenotype and the metastatic properties of a murine T- lymphoma cell line. Unexpected Co-Expression of CD4, CD3 and TCRβin T- Lymphoma Cells. Mongini C, Ruybal P, Gravisaco MJ, Croci M, Sánchez Lockhart M, Fabris V and Waldner C. In vitro Cell. Dev. Biol. 37 (9) 37. 499-504 (2001).
BHV-1 DNA vaccination: effect of the adjuvant RN-205 on the modulation of the immune response in mice. Zamorano, O. Taboga, M. Domínguez, A. Romera, M. Puntel, C. Tami, C. Mongini, C. Waldner, E. Palma and A. Sadir Vaccine: 20, 2656-2664 (2002).
RANKL expression in a case of follicular lymphoma. Barcala V, Ruybal P, García Rivello H, Waldner C, Ascione A, Mongini C. Eur J Hematol. 70: 417-419 (2003).
IL-2, IL-10, IL-15 and TNF are key regulators of a murine T-cell lymphoma growth. M J Gravisaco, C Mongini, E Alvarez, P Ruybal, A Escalada, M Sanchez-Lockhart, S Hajos and C Waldner International Journal of Molecular Medicine 12: 627-32 (2003).
Transgene expression enhancement in T-lymphoma cell lines. Ruybal P, Gravisaco MJ, Barcala V, Escalada , Cremaschi G, Taboga O, Waldner C, Mongini C. International Journal of Immunopharmacology. 5:1685-92 (2005).
Complete rejection of a T-cell lymphoma due to synergism of T-cell receptor costimulatory molecules, CD80, CD40L, and CD40. Ruybal P, Gravisaco MJ, Barcala V, Escalada A, Di Sciullo P, Waldner C, Mongini C. Vaccine 26:697-705; (2008).
LIBROS DETEXTO
C. Mongini, C. Waldner. Metodologías para la evaluación de las células inmunocompetentes. Capítulo 36. Inmunología e Inmunoquímica. 5º Edición. R. Margni y colaboradores. Editorial Panamericana. (1996).
ATCC: Métodos de Control de Calidad para Líneas Celulares. Participación en la traducción del libro ATCC Quality Control Methods for Cell Lines. Editorial Mapache. (1996).
formación de recursos humanos
Dirección de Técnicos Profesionales y no Profesionales, becarios, tesistas, pasantes, y estudiantes de las carreras de Bioquímica, Medicina y Ciencias Biológicas, como directora del Laboratorio de Inmunología Molecular del CEFYBO.
Formación de nuevos docentes, en los cursos dictados en la Cátedra de Inmunología de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la UBA, 1986/1997.
Dirección de auxiliares docentes, en ejercicio de la Jefatura de Trabajos Prácticos. Cátedra de Inmunología de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la UBA.
becarios otorgados por Instituciones académicas
Directora de Beca de Postgrado del CONICET de la médica Paula Di Sciullo. TÍTULO: ROL DE RANK- RANKL EN LA RESPUESTA INMUNE ANTI-TUMORAL. DISEÑO DE VACUNAS UTILIZANDO COMBINACIONES DE CÉLULAS TUMORALES. Desde abril de 2007.
Directora de Beca de Postgrado del CONICET de la licenciada Paula Ruybal. TÍTULO: Participación de las Moléculas Coestimuladoras en la Respuesta Inmune Anti-tumoral. Desde abril de 1998 hasta octubre de 2003.
dirección de tesis
Directora de la Tesis de Licenciatura de la estudiante de Ciencias Biológicas Paola De Luca. TÍTULO: Rol de RANK-RANKL, dos nuevas moléculas coestimuladoras del RcT, en la respuesta inmune antitumoral. En ejecución.
Directora de Tesis Doctoral de la licenciada Paula Ruybal. TÍTULO: Participación de las Moléculas Coestimuladoras en la Respuesta Inmune Anti-tumoral. Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad de Buenos Aires. Junio de 2004. Calificación: distinguido (9).
Co-Directora de la Tesis de Licenciatura de la estudiante de Ciencias Biológicas Paula Ruybal. TÍTULO: Apoptosis en Tejido Linfoide Asociado a Intestino. Una respuesta a la injuria o un Mecanismo Fisiológico. Noviembre de 1997. Calificación: 10.
subsidios recibidos en los últimos diez años
Integrante del grupo responsable del proyecto financiado por la ANPCyT (PICT 32404). Período 2007-2010. Tema: Desarrollo de vacunas antineoplásicas utilizando bacterias atenuadas como vectores de genes inmunomoduladores. Mecanismos inmunes responsables del efecto terapéutico antitumoral de una cepa genéticamente atenuada de Salmonella typhi.
Directora del Proyecto de Investigación Plurianual financiado por el CONICET (PIP 5330. Periodo: 2005-2006. Diseño y desarrollo de vacunas antitumorales empleando bacterias y células tumorales modificadas con genes inmunomoduladores. Estudio de los mecanismos inmunes inducidos.
Proyecto Estímulo a la Investigación (PEI 6331/01), del Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET). Tema: Estudio de diferentes mecanismos inmunes que participan en la modulación del crecimiento tumoral. Participación de las moléculas coestimuladoras del RcT en la respuesta inmune anti-tumoral.
Integrante del grupo responsable del proyecto financiado por la ANPCyT (PICT 05-10878/02). Período 2004-2006. Tema: Desarrollo de vacunas antineoplásicas utilizando bacterias atenuadas genéticamente como vectores para la transferencia in vivo de genes de citoquinas y moléculas coestimuladoras del RcT.
Co- Directora del Proyecto de Investigación Plurianual financiado por el CONICET (PIP 0229/00. Periodo: 2003-2004. Importancia de la transferencia de genes de citoquinas o de moléculas coestimuladoras del RcT en las células dencdríticas y tumorales para el desarrollo de vacunas contra el cáncer.
Directora del subsidio otorgado por The Third World Academy of Science. Tema: Regulation of apoptosis in leukemic cells by glucocorticoids and cytokines. Período 1999-2000.
Proyecto Estímulo a la Investigación (PEI 0186/98), del Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), período 1999. Tema: Participación de las moléculas coestimulatorias en la respuesta antitumoral.
Directora del subsidio otorgado por la Fundación Alberto J. Roëmmers para la Investigación clínica médica básica. Tema: Relación entre las moléculas de adhesión y la diseminación tumoral. Su importancia en la predicción de metástasis. Período 1995-1998.
Universidad de Buenos Aires, subsidio para asistir al IX Congreso Internacional de Inmunología realizado en San Francisco. Agosto de 1995.
Subsidio otorgado por la International Union of immunological Societies (IUIS) para presentar dos trabajos en el IX Congreso Internacional de Inmunología realizado en San Francisco (USA), entre el 23 y el 29 de Julio de 1995.
otros antecedentes
Comunicaciones Presentadas en Reuniones Científicas
Nacionales : 30
Internacionales : 26
ACTUACIÓN EN ORGANISMOS DE PLANEAMIENTO , PROMOCIÓN O EJECUCIÓN
Integrante del Banco de Evaluadores externos del British Journal of Hematology. Desde mayo de 2003.
Integrante del Banco de Evaluadores externos del Journal of Gene Medicine. Desde noviembre de 2004.
Integrante del Banco de Evaluadores de la Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica. Desde julio de 2002.
Integrante del Banco de Evaluadores del CONICET para evaluar becarios y proyectos de investigación. Desde enero de 1999.
Asociación Banco Argentino de Células (ABAC), miembro de la Comisión Directiva: Presidenta. Desde octubre de 2004.
Reconocimientos Científicos
Investigador invitado a presentar un trabajo en el 4th International Symposium on Predictive Oncology & Therapy. Impact of Biotechnology on cancer, prognosis, detection. Prevention. Niza, Francia. 24 -27 de Octubre de 1998
Curriculum Vitae
Nombre y apellido: Claudia Ines Waldner
Fecha y lugar de nacimiento: 29 de Agosto de 1960, Buenos Aires
DNI: 14.386.127
E mail: claudiawaldner@yahoo.com
Lugar de trabajo: Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos (CEFYBO)
Cargo y funcion actual
Investigador Adjunto del CONICET. Director del laboratorio de Inmunología Celular del CEFYBO. Facultad de Medicina de la UBA.
TÍTULOS UNIVERSITARIOS
Bioquímica, UBA. 1985
Farmacéutica, UBA. 1987
MÁXIMO TÍTULO ACADÉMICO
Dra. de la Universidad de Buenos Aires, 1994.
Tesis: Participación de las citoquinas en el crecimiento tumoral y en la respuesta inmune antitumoral.
AREA TEMÁTICA: Inmunología, Inmunología tumoral, Oncología
CARGOS ACTUALES EN INVESTIGACIÓN
- Directora del Laboratorio de Inmunología Celular del Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos (CEFYBO-CONICET). Facultad de Medicina de la UBA.
- Miembro de la Carrera del Investigador Científico del CONICET, Investigador Adjunto.
ANTECEDENTES EN TAREAS DESARROLLADAS EN AMBITOS CIENTÍFICOS NACIONALES Y EXTRANJEROS
Antecedentes como Investigador
•Integrante del Laboratorio de Inmunología Tumoral. IDEHU-CONICET desde 1986 hasta 1998.
•Director del Grupo de Investigación de Inmunología Celular, IDEHU-CONICET. 3/1999- 2/ 2001.
•Director del Laboratorio de Inmunología Celular, CEFYBO-CONICET. Desde Marzo de 2001.
Becas obtenidas
Premio "Florencio I. Fiorini". Otorgado por LALCEC, al mejor trabajo sobre cáncer experimental: Inducción de mecanismos inmunes que limitan el desarrollo tumoral. Octubre de 1995. Premio "Jornadas científicas 1997". Nested-PCR para la detección de isoformas de la molécula de adhesión CD44. Academia Nacional de Farmacia y Bioquímica. Agosto de 1998. Premio "Bernardo Houssay" 2004. Otorgado por la Sociedad Argentina de Biología. Título del trabajo: "Rechazo de un linfoma murino T por transferencia genética con las moléculas CD40, CD80 CD40L". Noviembre de 2004.
Fecha y lugar de nacimiento: 29 de Agosto de 1960, Buenos Aires
DNI: 14.386.127
E mail: claudiawaldner@yahoo.com
Lugar de trabajo: Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos (CEFYBO)
Cargo y funcion actual
Investigador Adjunto del CONICET. Director del laboratorio de Inmunología Celular del CEFYBO. Facultad de Medicina de la UBA.
TÍTULOS UNIVERSITARIOS
Bioquímica, UBA. 1985
Farmacéutica, UBA. 1987
MÁXIMO TÍTULO ACADÉMICO
Dra. de la Universidad de Buenos Aires, 1994.
Tesis: Participación de las citoquinas en el crecimiento tumoral y en la respuesta inmune antitumoral.
AREA TEMÁTICA: Inmunología, Inmunología tumoral, Oncología
CARGOS ACTUALES EN INVESTIGACIÓN
- Directora del Laboratorio de Inmunología Celular del Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos (CEFYBO-CONICET). Facultad de Medicina de la UBA.
- Miembro de la Carrera del Investigador Científico del CONICET, Investigador Adjunto.
ANTECEDENTES EN TAREAS DESARROLLADAS EN AMBITOS CIENTÍFICOS NACIONALES Y EXTRANJEROS
Antecedentes como Investigador
•Integrante del Laboratorio de Inmunología Tumoral. IDEHU-CONICET desde 1986 hasta 1998.
•Director del Grupo de Investigación de Inmunología Celular, IDEHU-CONICET. 3/1999- 2/ 2001.
•Director del Laboratorio de Inmunología Celular, CEFYBO-CONICET. Desde Marzo de 2001.
Becas obtenidas
Beca Doctoral del CONICET, Cátedra de Inmunología. Facultad de Farmacia y Bioquímica, UBA-IDEHU. Tema: Caracterización de un factor supresor de la proliferación celular in vitro, presente en el suero de ratones portadores del tumor LB. Su relación con citoquinas que modifican el crecimiento celular. Abril de 1989 - Marzo de 1994.
Beca Post-doctoral del CONICET, Cátedra de Inmunología. Facultad de Farmacia y Bioquímica, UBA-IDEHU. Tema: Estudio de mecanismos involucrados en la regulación del crecimiento de una leucemia T murina. Detección de citoquinas por RT-PCR. Abril de 1994- 31 de Julio de 1997.
Pasantías en el exterior
Laboratorio de Inmunología Celular y Citometría de Flujo, Centro de desarrollo de Vacunas (CVD), Escuela de Medicina, Universidad de Maryland, Baltimore, Estados Unidos. Mayo de 1997.
ANTECEDENTES DOCENTES
•Docente de la Cátedra de lnmunología, Facultad de Farmacia y Bioquímica, UBA. Desde el 5/85 hasta 3/02.
•Auxiliar docente de Microbiología, carrera de Farmacia, Facultad de Farmacia y Bioquímica, UBA. 1986-1988.
•Docente del VI Curso Internacional de Inmunoquímica Avanzada. IDEHU, CONICET-UBA. Mayo-Junio de 1989.
•Docente del curso de Inmunología de la Maestría en Salud Animal, Facultad de Ciencias Veterinarias, Abril de 1992.
•Docente del Curso de postgrado, Inmunología Tumoral. Función de las moléculas de adhesión en las metástasis. IDEHU, CONICET, UBA. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Marzo de 1994.
•Docente del Curso de postgrado, Inmunología Comparada de vertebrados e invertebrados. IDEHU, CONICET-UBA. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Marzo de 1998.
•Docente de los cursos de Capacitación Docente, Cátedra de Inmunología. Facultad de Farmacia y Bioquímica, UBA, 1986-2001.
- Jefe de Trabajos Prácticos, Docente de la Cátedra de lnmunología, Facultad de Farmacia y Bioquímica, UBA. Desde el 12/97 al 03/02.
PREMIOS Y DISTINCIONES
PUBLICACIONES, últimos 5 años
Induction of apoptosis in murine lymphoma cells by cyclosporin A. Mongini C, Waldner C, Calda Lopes E, Gravisaco MJ, Sánchez Lockhart M, Alvarez E & Hajos S. Int J Mol Med. 7:431-7, 2001.
Characterization of the Immunophenotype and the metastatic properties of a murine T- Lymphoma cell line. Unexpected Expression of cytoplasmatic CD4 in T- Lymphoma Cells. Mongini C, Ruybal P, Gravisaco MJ, Croci M, Sánchez Lockhart M, Fabris V & Waldner C. In Vitro Cell. Dev. Biol, 37: 499-504, 2001.
BHV-1 DNA vaccination: effect of the adjuvant RN-205 on the modulation of the immune response in mice. Zamorano, O. Taboga, M. Domínguez, A. Romera, M. Puntel, C. Tami, C. Mongini, C. Waldner, E. Palma and A. Sadir. Vaccine, 20: 2656-64, 2002.
IL-2, IL-10, IL-15 and TNF are key regulators of murine T-cell lymphoma growth Gravisaco MJ, Mongini C, Alvarez E, Ruybal P, Escalada A, Sanchez-Lockhart M, Hajos S, Waldner C. Int J Mol Med, 12:627-32, 2003.
RANKL expression in a case of follicular lymphoma. Barcala V, Ruybal P, Garcia Rivello H, Waldner C, Ascione A, Mongini C. Eur J Haematol, 70:417-9, 2003.
Transgene expression enhancement in T-lymphoma cell lines. Ruybal P, Gravisaco MJ, Barcala V, Escalada A, Cremaschi G, Taboga O, Waldner C, Mongini C. International Immunopharmacology.5: 1685-92, 2005.
Complete rejection of a T-cell lymphoma due to synergism of T-cell receptor costimulatory molecules, CD80, CD40L, and CD40. Ruybal P, Gravisaco MJ, Barcala V, Escalada A, Di Sciullo P, Waldner C, Mongini C. Vaccine 26:697-705; 2008.
LIBROS DE TEXTO
Metodologías para la evaluación de las células inmunocompetentes. Mongini C y Waldner C. Capítulo 36. Pág. 697-751. En Inmunología e Inmunoquímica. 5º Edición. R. Margni y colaboradores. Editorial Panamericana. 1996.
FORMACIÓN DE RECURSOS HUMANOS
Becarios otorgados por instituciones académicas
- Veterinaria Alejandrina Vendrell. Dirección de la Beca de Iniciación de la ANPCYT titulada: Desarrollo de vacunas antineoplásicas utilizando bacterias atenuadas genéticamente como vectores para la transferencia in vivo de genes de citoquinas. 2005-2006.
- Dra María José Gravisaco. Dirección de la Beca Postdoctoral del CONICET titulada: Desarrollo de vacunas antitumorales intranasales que utilicen bacterias atenuadas como vehículos de transporte de genes de citoquinas y moléculas coestimuladoras. 2003-2005
- Licenciada Paula Ruybal. Codirección de la Beca de Postgrado del CONICET titulada: Participación de las Moléculas Coestimuladoras en la Respuesta Inmune Anti-tumoral. 1999- 2003.
Dirección o codirección de tesistas de la UBA
- Dr. Mariano Sánchez Lockhart (tesis aprobada, 1999) y Dra. María José Gravisaco (tesis aprobada 2002).
- Luciana Balboa, Tesis de Licenciatura de la UBA, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Director, 2004- 2006. Tesis aprobada 2007.
- Veterinaria Alejandrina Vendrell, estudiante de la Maestría de Biotecnología de la UBA, 2006-.
SUBSIDIOS RECIBIDOS
- Desarrollo de vacunas antineoplásicas utilizando bacterias atenuadas como vectores de genes inmunomoduladores. Mecanismos inmunes responsables del efecto terapéutico antitumoral de una cepa genéticamente atenuada de Salmonella typhi. Director del Proyecto, PICT 32404/2005, Proyecto financiado por ANPCyT. 2007-2010.
- Diseño y desarrollo de vacunas antitumorales empleando bacterias y células tumorales modificadas con genes inmunomoduladores. Estudio de los mecanismos inmunes inducidos. Codirector del Proyecto. Proyecto de Investigación Plurianual financiado por el CONICET (PIP 5330/2005). 2005-2007.
- Desarrollo de vacunas antineoplásicas utilizando bacterias atenuadas genéticamente como vectores para la transferencia in vivo de genes de citoquinas y moléculas coestimuladoras del RcT. Director del Proyecto, PICT 10878/2002, Proyecto financiado por ANPCyT. 2004-2006.
- Importancia de la transferencia de genes de citoquinas o de moléculas coestimuladoras del receptor T en las células dendríticas y tumorales para el desarrollo de vacunas contra el cáncer. Director del Proyecto. Proyecto de Investigación Plurianual financiado por el CONICET (PIP 02291/2000). 2002-2005.
- Relación entre la expresión de isoformas de la molécula de adhesión CD44 y la capacidad metastizante de los tumores. Codirección. Fundación Alberto Röemmers. 1995-1997.
Introducción
Tumor o neoplasia
Los tumores o neoplasias se pueden originar debido a una alteración de células que provoca un aumento en su proliferación de manera descontrolada.
Las neoplasias benignas no son consideradas como cáncer, ya que estas células no se extienden a otras partes del cuerpo, permanecen juntas y a menudo son rodeadas de una membrana de contención o cápsula; generalmente se los puede extirpar y, en la mayoría de los casos, no vuelven a aparecer. Los tumores benignos no constituyen generalmente una amenaza para la vida.
Hay diferentes tipos de tumores benignos, que se clasifican de acuerdo al tejido y al tipo celular de origen:
• papiloma: masa protuberante en la piel (verruga, quiste).
• adenoma: tumor que crece en las glándulas y en torno a las mismas.
• osteoma: tumor de origen en el hueso.
• mioma: tumor del tejido muscular.
En cambio los tumores malignos originan un cáncer. Las células tumorales malignas además de crecer sin control, tienen las propiedades de invadir y destruir órganos de alrededor, y pueden entrar en el sistema linfático o en el flujo sanguíneo, que es la manera como alcanzan otras partes del cuerpo. Esta propagación del tumor en sitios lejanos se denomina metástasis. Generalmente, los tumores se dividen en tres categorías de acuerdo a su origen:
• carcinomas: estos cánceres se originan en el epitelio, que es el tejido que recubre de las células de un órgano. Los carcinomas constituyen el tipo más común de cáncer. Los lugares comunes de carcinomas son la piel, la boca, el pulmón, los senos, el estómago, el colon y el útero.
• sarcomas: Los sarcomas son canceres del tejido conectivo y de sostén (tejidos blandos) de todos los tipos. Los sarcomas se encuentran en cualquier parte del cuerpo y frecuentemente forman crecimientos secundarios o metástasis en los pulmones.
• teratoma inmaduro: estos tumores cancerosos poco frecuentes se asemejan a tejidos embrionarios o fetales.(3)
Antígenos tumorales:
Cuando las células tumorales expresan antigenos que no expresan las células normales, el sistema inmunológico reconoce a estos como extraños y causa que las células que lo componen, ataquen a estas células tumorales transformadas.
La primera demostración experimental de que los tumores pueden inducir la respuesta inmune protectora proviene de estudios de transplantes de tumores hechos en 1950. Un sarcoma fue inducido en un ratón pintando su piel con un químico cancerígeno (metil colantreno). Los resultados del experimento demostraron que si el tumor inducido es extirpado y transplantado en otros ratones singeneicos (que poseen los mismos antígenos de histocompatibilidad que los de la célula cancerosa) el tumor crece. En cambio, si el tumor es transplantado nuevamente en el hospedador original que se ha vuelto inmune a éste, el ratón rechaza el tumor, pero es incapaz de rechazar el tumor inducido producido por los otros ratones. Además, los linfocitos T obtenidos del ratón portador del sarcoma pueden transmitir una inmunidad protectora contra el tumor cuando son transferidos a un animal normal libre de tumor. Por lo tanto, las respuestas inmunes a tumores exhiben las principales características de la respuesta inmunológica adaptativa, específidad y memoria, y son mediadas por linfocitos. Pero frecuentemente el sistema inmune responde mal al crecimiento de tumores y no erradica las células transformadas.
Una variedad de antígenos tumorales que puede ser reconocidas por linfocitos T y B han sido identificados en cánceres de humanos y de animales. Estos inducen una respuesta inmune adaptativa.
La primera clasificación de antígenos tumorales fue basada en sus formas de expresión. Los antígenos que se expresan en células tumorales pero no en células normales son llamados antígenos específicos del tumor. Quitar lo que decía aquí en el texto original. Aquellos que son también expresados en células normales son llamados antígenos asociados al tumor (son constituyentes de células normales cuya expresión es desregularizada o aberrante en tumores). La clasificación moderna de antígenos tumorales se basa en la estructura molecular y el origen de estos.
Antígenos de virus oncogénicos
El producto de virus oncogénicos son antígenos tumorales inductores de una respuesta específica de células T. Los virus de ADN o ARN (retrovirus) están implicados en varios tumores en humanos y animales experimentales. En la mayoría de los tumores inducidos por ADN virus se encuentran las proteínas antigénicas del virus en el núcleo, el citoplasma, o en la membrana plasmática de las células tumorales. Estas proteínas sintetizadas en forma endógena, dentro de la célula, pueden ser procesadas, degradas a péptidos y expresados en la superficie de la célula tumoral. Teóricamente tienen el mismo potencial como antígeno que las células mutantes.
Antígenos oncofetales
Los antígenos oncofetales son proteínas que son expresadas a altos niveles en células cancerosas y en fetos en desarrollo pero no en tejidos adultos. Se cree que los genes de estas proteínas son silenciados durante el desarrollo fetal y son activados durante las transformaciones malignas.
Antígenos alterados de glucolípidos y glucoproteínas
La mayoría de los tumores experimentales y humanos se expresan en mayor nivel de lo normal o de formas anormales de glucoproteínas y glucolípidos de la superficie celular. Estas moléculas alteradas incluyen gangliósidos y antígenos de grupos sanguíneos. Algunos aspectos del fenotipo maligno, incluyendo la invasión de tejidos y su capacidad de hacer metástasis, pueden reflejar en la superficie de la célula alterada, propiedades que resultan de una síntesis de glucolípidos y glucoproteínas anormales.
Antígenos diferenciales específicos de tejidos
Son llamados antígenos diferenciales los que son específicos a tejidos particulares o etapas de diferenciación de varios tipos de célula. Son agentes considerados como blancos potenciales para inmunoterapia, para la identificación del tejido original de los tumores y se pueden detectar en la superficie celular.
Elementos de la respuesta inmune antitumoral:
Los células inmunes efectoras que contribuyen a una respuesta protectora contra el desarrollo de un tumor pertenecen tanto a la inmunidad innata como a la inmunidad adaptativa o específica.
Varios estudios histopatológicos demostraron que muchos tumores son rodeados por células mononucleares compuestos por linfocitos T, células NK (asesinas naturales) y macrófagos; siendo éstas las principales células efectoras que atacan a las células tumorales.
Respuesta inmune innata:
Células NK
Esta célula asesina tiene la capacidad de diferenciar las células infectadas por un virus, o las células tumorales que han sufrido transformaciones malignas. Esto pasa gracias a que los receptores de membrana de la célula asesina detectan la ausencia de las moléculas de histocompatibilidad en este tipo de células dañadas, y así se activanlas nkpara matar a la célula tumoral. Este sistema sencillo de reconocimiento es muy eficaz. Además de este sistema, liberan interferón gamma y otras citoquinas para desencadenar su respuesta inespecífica y, destruir a la célula que ha presentado dicha sustancia. Al reconocer la célula infectada, se unen a ella y a través de una proteína llamada perforina crean poros en su membrana por los que pasan enzimas llamadas granzimas que inducen la muerte por apoptosis de la célula blanco.
Macrófagos
La función principal de un macrófago es fagocitar, inician una respuesta natural, ya que los macrófagos expresan receptores de membrana; estos en el sistema inmune antitumoral, fagocitan mas eficazmente a las células tumorales que a las normales. Los macrófagos matan a células tumorales probablemente de la misma manera que eliminan a los organismos infecciosos, y activan a otros macrófagos.
Respuesta inmune adaptativa:
Linfocitos T
El principal mecanismo de inmunidad tumoral es matar a las células tumorales mediante los linfocitos T citotóxicos (LTCs), que son LT CD8+. La característica de LTCs para proveer una efectiva respuesta inmune antitumoral in vivo esta visto experimentalmente en animales con carcinógenos inducidos. Los CTLs pueden desempeñar una función de vigilancia, reconociendo y matando células potencialmente malignas que expresen péptidos derivados de una proteína celular mutante o proteínas virales oncogénicas. Son tan específicas en sus funciones letales que son capaces de destruir a la célula blanco sin afectar a las células vecinas no infectadas.
Los moléculas CD8 son glicoproteinas co-receptoras de linfocitos T expresadas en la membrana de los LTCs .
Los glicoproteína CD4+ o son moléculas que se expresa en la superficie de células T colaboradoras. En respuesta a antígenos solubles se induce la proliferación de células T CD4+; estos LTCD4 colaboran en la activación y la diferenciación de las células B en células secretoras de inmunoglobulinas. Participan también en la respuesta inmune antitumoral, proveyendo citoquinas para efectivizar el desarrollo de las LTCs (4 y 8).
La presentación de antígenos estimula a los linfocitos T (células) a convertirse ya sea en"citotóxicos" CD8+ o "colaboradores" CD4+.(4)
Anticuerpos
El huésped que posee un tumor puede producir anticuerpos contra varios antígenos tumorales. Los anticuerpos unidos a los antígenos tumorales expresados en la superficie de la célula tumoral, pueden matar al tumor por la activación del complemento o por citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo a cargo células NK o macrófagos.
Cada anticuerpo se une a su antígeno específico en una interacción similar a la de una llave y una cerradura.(4)
Evasión de los tumores a la respuesta inmune:
Muchos tumores malignos poseen mecanismos que les posibilitan evadir o resistir respuestas inmunes del huésped.
Las células tumorales son derivadas de células huéspedes y pueden confundirse con células normales en muchos aspectos. La mayoría de los tumores expresan solo unos pocos antígenos que pueden ser reconocidos y tienden a producir una respuesta inmunológica. Los tumores que inducen una respuesta inmune fuerte, incluyen los inducidos por virus oncogénicos, en los cuales las proteínas virales son antígenos extraños, y los tumores (inducidos en animales) por carcinógenos, las cuales casi siempre causan mutaciones en genes de la células normales.
El rápido crecimiento y expansión de tumores pueden confundir la capacidad del sistema inmune para eliminar las células tumorales.
Además, muchos tumores tienen mecanismos especializados para evadir las respuestas inmunes contra el huésped:
Los antígenos tumorales pueden inducir una tolerancia inmunológica específica. La tolerancia puede ocurrir porque estos antígenos son considerados como propios por el sistema inmune o porque las células tumorales los presentan de una forma tolerante a los linfocitos.
Los linfocitos T reguladores pueden suprimir las respuestas de linfocitos T contra los tumores. El número de linfocitos T reguladores puede incrementarse en cada paciente y encontrarse como linfocitos inflitrantes dentro del tumor.
Las células tumorales pierden la expresión de los antígenos que estimulan las respuestas inmunes.
Los tumores fallan en la inducción de la activación de los LTCs debido a que muchas células tumorales no expresan moléculas coestimuladoras o moléculas de histocompatibilidad de claseII, impidiendo que la respuesta inmune se propague. Las moléculas coestimuladoras son necesarias para la iniciación de la respuesta inmune de células T y las moléculas de histocompatibilidad de clase II son necesarias para la activación de los LT CD4+ (colaboradores), los cuales son requeridos para la activación de los LTCs para que actúen. Una de las principales moléculas coestimuladoras es la molécula B7.1 o CD80.
Inmunoterapia para tumores
La inmunoterapia tiene como meta lograr la estimulación del sistema inmune y por lo tanto lograr una respuesta delimitada a las células cancerígenas.
Los tratamientos de pacientes con cáncer usando un enfoque inmunológico han originado grandes promesas para la oncología. La principal causa es que las terapias actuales para cáncer se basan en el empleo de drogas o radiaciones que matan a las células o bloquean la división celular, y estos tratamientos tienen severos efectos sobre la proliferación de las células normales. Como resultado, los tratamientos contra el cáncer causan un efecto secundario indeseado que se manifiesta como un malestar importante de los pacientes.
Las vacunas anti-tumorales más tempranas se enfocaron en la inmunización con antígenos tumorales purificados junto con adyuvantes (que son sustancias inflamatorias que por administración local funcionan como activadores de células que participan activando a los linfocitos). En la actualidad se utilizan estrategias más complejas que involucran la inmunización de pacientes con cáncer utilizando células dendríticas purificadas de pacientes transfectadas con plásmidos que poseen genes de antígenos tumorales o incubadas con células tumorales.
Entre las estrategias de inmunoterapia se encuentran:
• Activación no específica del sistema inmune: Con esta modalidad se logra una estimulación inespecífica del sistema inmune. Para esto se han utilizado diferentes elementos inmunoestimulantes. Utiliza bacterias atenuadas como la vacuna BCG (Bacilo Calmette Guerin) o el Corynebacterium parvum y granulosum. Sustancias inflamatorias o adyuvantes: P40, Polyerga, Titermax, etc.
• Activación específica del sistema inmune: Se basa en la inoculación de antígenos tumorales para obtener respuestas inmunes específicas contra el tumor. Si bien en sus inicios se centró la atención en la obtención de vacunas preventivas, en la actualidad se evalúa esta modalidad como arma terapéutica, aceptándose ya el término de vacunas terapéuticas, lo cual se refiere a la inoculación al paciente portador de un tumor maligno, de antígenos presentes en el tumor, en una formulación vacunal que permite incrementar la inmunogenicidad para obtener respuestas inmunes específicas eficientes. Como ejemplo existen las vacunas de células tumorales, vacunas de extractos celulares, vacunas donde se utilizan antígenos tumorales purificados o recombinantes (MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE, MUC-1), vacunas con células dendríticas expresando antígenos tumorales.
• Inmunoterapia Pasiva no específica: Consiste en la administración de elementos del sistema inmune (moléculas o células) procedente de otro organismo, que logran una estimulación inmunológica no antígeno-específica en el portador de un tumor maligno. Por ejemplo células activadas por linfoquinas; citoquinas: IL-2, TNF, IFNα, IFNγ, factores de crecimiento hematopoyéticos.
• Inmunoterapia Pasiva específica: Al igual que en la modalidad anterior se inoculan elementos inmunológicos al organismo portador de un tumor maligno, pero en este caso estos elementos sí reconocen antígenos en las células tumorales, desplegando mecanismos que llevan a su destrucción . Las inmunoterapia pasivas incluyen la transferencia de los efectores inmunes, incluyendo anticuerpos y las células T específicas contra el tumor: Linfocitos infiltrantes de tumores. Inmunotoxinas (anticuerpos monoclonales acoplados a toxinas, radioisótopos, drogas citotóxicas). Anticuerpos anti-idiotípicos. Anticuerpos biespecíficos. Esta terapia contra tumores es rápida pero no perdura por mucho tiempo.
En todas estas modalidades de estimulación la consecuencia final es lograr respuestas inmunes específicas para rechazar a los tumores y no dañar a las células normales.
En la respuesta inmune antitumoral se generan también anticuerpos específicos contra las células neoplásicas. Los anticuerpos monoclonales tumor-específicos pueden ser provechosos para inmunoterapia específica para tumores. Estos pueden erradicar tumores por los mismos mecanismos efectores que son usados para eliminar microbios, incluyendo la fagocitosis y la activación del sistema complementario. Hay actualmente al menos cien diferentes tipos de anticuerpos monoclonales que son empleados, tanto en estudios con animales experimentales o en pacientes, como agentes terapéuticos para cáncer, y algunos han sido aprobados para usos clínicos. Sin embargo las respuestas obtenidas con los anticuerpos no tienen la magnitud de las que se logran con las células citotóxicas. Del estudio de los diferentes mecanismos puestos en marcha, la respuesta inmune por la inducción de células T específicas contra las células cancerígenas es la táctica más eficiente para lograr el rechazo del tumor.
Es por ello que las vacunas contra las neoplasias tienen por objeto primordial la estimulación de células T. Un adelanto trascendente en la inmunología tumoral fue el desarrollo de técnicas para identificar antígenos que son reconocidos por los linfocitos T tumor-específicos CD8+ y CD4+. Los antígenos que son reconocidos en general son péptidos derivados de proteínas normales que han sufrido una mutación o alteración que pueden encontrarse en el citoplasma o expresadas en la superficie de la célula tumoral.
Una estrategia para el aumento de la inmunidad del huésped contra los tumores con moléculas co-estimuladoras de la respuesta inmune y citoquinas.
La inmunidad mediada por células puede ser mejorada por la expresión de moléculas co-estimuladores y citoquinas en las células tumorales que estimulan la proliferación y diferenciación de linfocitos T y células NK. Las células tumorales pueden inducir una respuesta inmune débil porque ellas carecen de moléculas coestimuladores. Dos maneras importantes para impulsar la respuesta del huésped a tumores son proveer artificialmente co-estimulación para células T citoquinas que mejoren la activación de células T especificas, particularmente de CTLs, CD8+.
Modelos de tumores del proyecto:
Este trabajo de investigación utiliza dos modelos tumorales que se desarrollan en ratones de la cepa BALB/c. Ellos son el linfoma murino LBC y el tumor de mama LM3.
Carcinoma de mama LM3
Hace más de 20 años que fue descripto el adenocarcinoma mamario de ratones BALB/c. Desde entonces, este tumor ha sido mantenido mediante pasajes subcutáneos en ratones singeneicos. La línea LM3 fue establecida a partir de cultivos primarios de tumores M3 mediante sucesivos pasajes in vitro. Las monocapas de células LM3 están mayoritariamente (más del 95%) constituidas por células epiteliales poliédricas que son homogéneas en cuanto al tamaño y a la forma del citoplasma y del núcleo. El análisis histopatológico de tumores LM3 en ratones BALB/c inoculados en forma subcutánea han demostrado que estas células generan adenocarcinomas pobremente diferenciados con alta capacidad invasiva, observándose invasión de la dermis y de las capas musculares y adiposas subcutáneas, con células tumorales no polarizadas desprovistas de organización y con escaso estroma entre estas. In vivo, la línea LM3 es capaz de producir metástasis específicamente en pulmón. (1)
Linfoma T, LBC
El tumor denominado LB se originó espontáneamente en un ratón de la cepa BALB/c en el bioterio de la Academia Nacional de Medicina. La línea celular LBC derivada del linfoma LB induce una respuesta inmune humoral y celular débil en ratones singénicos.
Esta línea crece como cultivo en suspención y fue establecida a partir de un linfoma T murino espontáneo de alta agresividad desarrollado en un ratón BALB/c. El análisis por tinción y microscopía óptica mostró que las células presentan una apariencia linfoblastoide de tamaño mediano a grande (menos o igual a 15 μm), núcleo redondeado con nucleolo prominente y ausencia de granos azurofilos. La inoculación por vía intraperitoneal de estas células producen la muerte de los animales en un tiempo medio de 20 días. La simple observación de estos muestra el desarrollo de ascitis evidente a partir de los 12 días post inoculación (2).
En el año 1994 se probó que la transferencia de células LBC transfectadas con genes del complejo mayor de histocompatibilidad ha podido inducir en los ratones una respuesta inmune capaz de rechazar un inoculo grande de células tumorales (un millón) y prolongar el tiempo de sobrevida de estos. En el 2001 se ha llevado a cabo una transfección de esta línea con la molécula coestimuladora CD80, logrando un 39% de células positivas para el marcador del en la población total de células tumorales. Si bien ningún ratón singeneico inmuno-competente inoculado por vía intraperitoneal rechazó el tumor, el tiempo medio de sobrevida de los ratones aumentó en cuatro días con respecto a las células BALB/c sin transfectar. De esta manera las células LBC presentan un modelo de linfoma T espontáneo, poco inmunogénico (hecho que simula la mayoría de los tumores humanos) y que fue extensamente estudiado con sus propiedades inductoras de una respuesta inmune antitumoral.
Objetivos:
El objetivo principal de este proyecto es el desarrollo de vacunas anti-tumorales usando células tumorales genéticamente modificadas y plásmidos que posean genes que codifica para moléculas inmunomoduladores que activen la respuesta inmune del huésped para el rechazo de las neoplasias. Para ello se desarrollaran vacunas empleando plásmidos que poseen genes de las citoquinas IL15 e IL12, que serán utilizados como vectores, o células tumorales transfectadas para expresar las moléculas CD40, CD80 o RANKL. La efectividad se evaluará por su capacidad de controlar el establecimiento de metástasis y/o erradicar una neoplasia establecida.
Objetivos especifícos
• Amplificación y purificación de los plásmidos de interés utilizando el kit “QIAGEN PLASMID MAXI KIT”, que se basa en la lisis alcalina de las bacterias que contienen plásmido y el pasaje por columnas de intercambio iónico.
• Análisis de la pureza de los plásmidos obtenidos por espectrofotometría a 260, 280 y 310 nm.
• Determinación de la concentración de DNA por espectrofotometría a 260 nm.
• Determinación de la identidad del plásmido por digestión con enzimas de restricción y análisis del patrón de restricción en geles de agarosa y la comparación con patrones de peso molecular conocido.
• Determinación de la ausencia de contaminación con DNA geonómico en el gel agarosa.
• Inoculación de células del linfoma murino LBC y del tumor de mama LM3 en ratones singenéicos BALB/c.
• Tratamiento inmunológico de los tumores establecidos por inoculación de los plásmidos en ratones portadores de tumores o por inmunización con las células tumorales transformadas genéticamente.
• Seguimiento de la evolución de los tratamientos por medio de la medición de los tumores sólidos o por el análisis de curvas de sobreviva de los ratones desafiados.
Tumor o neoplasia
Los tumores o neoplasias se pueden originar debido a una alteración de células que provoca un aumento en su proliferación de manera descontrolada.
Las neoplasias benignas no son consideradas como cáncer, ya que estas células no se extienden a otras partes del cuerpo, permanecen juntas y a menudo son rodeadas de una membrana de contención o cápsula; generalmente se los puede extirpar y, en la mayoría de los casos, no vuelven a aparecer. Los tumores benignos no constituyen generalmente una amenaza para la vida.
Hay diferentes tipos de tumores benignos, que se clasifican de acuerdo al tejido y al tipo celular de origen:
• papiloma: masa protuberante en la piel (verruga, quiste).
• adenoma: tumor que crece en las glándulas y en torno a las mismas.
• osteoma: tumor de origen en el hueso.
• mioma: tumor del tejido muscular.
En cambio los tumores malignos originan un cáncer. Las células tumorales malignas además de crecer sin control, tienen las propiedades de invadir y destruir órganos de alrededor, y pueden entrar en el sistema linfático o en el flujo sanguíneo, que es la manera como alcanzan otras partes del cuerpo. Esta propagación del tumor en sitios lejanos se denomina metástasis. Generalmente, los tumores se dividen en tres categorías de acuerdo a su origen:
• carcinomas: estos cánceres se originan en el epitelio, que es el tejido que recubre de las células de un órgano. Los carcinomas constituyen el tipo más común de cáncer. Los lugares comunes de carcinomas son la piel, la boca, el pulmón, los senos, el estómago, el colon y el útero.
• sarcomas: Los sarcomas son canceres del tejido conectivo y de sostén (tejidos blandos) de todos los tipos. Los sarcomas se encuentran en cualquier parte del cuerpo y frecuentemente forman crecimientos secundarios o metástasis en los pulmones.
• teratoma inmaduro: estos tumores cancerosos poco frecuentes se asemejan a tejidos embrionarios o fetales.(3)
Antígenos tumorales:
Cuando las células tumorales expresan antigenos que no expresan las células normales, el sistema inmunológico reconoce a estos como extraños y causa que las células que lo componen, ataquen a estas células tumorales transformadas.
La primera demostración experimental de que los tumores pueden inducir la respuesta inmune protectora proviene de estudios de transplantes de tumores hechos en 1950. Un sarcoma fue inducido en un ratón pintando su piel con un químico cancerígeno (metil colantreno). Los resultados del experimento demostraron que si el tumor inducido es extirpado y transplantado en otros ratones singeneicos (que poseen los mismos antígenos de histocompatibilidad que los de la célula cancerosa) el tumor crece. En cambio, si el tumor es transplantado nuevamente en el hospedador original que se ha vuelto inmune a éste, el ratón rechaza el tumor, pero es incapaz de rechazar el tumor inducido producido por los otros ratones. Además, los linfocitos T obtenidos del ratón portador del sarcoma pueden transmitir una inmunidad protectora contra el tumor cuando son transferidos a un animal normal libre de tumor. Por lo tanto, las respuestas inmunes a tumores exhiben las principales características de la respuesta inmunológica adaptativa, específidad y memoria, y son mediadas por linfocitos. Pero frecuentemente el sistema inmune responde mal al crecimiento de tumores y no erradica las células transformadas.
Una variedad de antígenos tumorales que puede ser reconocidas por linfocitos T y B han sido identificados en cánceres de humanos y de animales. Estos inducen una respuesta inmune adaptativa.
La primera clasificación de antígenos tumorales fue basada en sus formas de expresión. Los antígenos que se expresan en células tumorales pero no en células normales son llamados antígenos específicos del tumor. Quitar lo que decía aquí en el texto original. Aquellos que son también expresados en células normales son llamados antígenos asociados al tumor (son constituyentes de células normales cuya expresión es desregularizada o aberrante en tumores). La clasificación moderna de antígenos tumorales se basa en la estructura molecular y el origen de estos.
Antígenos de virus oncogénicos
El producto de virus oncogénicos son antígenos tumorales inductores de una respuesta específica de células T. Los virus de ADN o ARN (retrovirus) están implicados en varios tumores en humanos y animales experimentales. En la mayoría de los tumores inducidos por ADN virus se encuentran las proteínas antigénicas del virus en el núcleo, el citoplasma, o en la membrana plasmática de las células tumorales. Estas proteínas sintetizadas en forma endógena, dentro de la célula, pueden ser procesadas, degradas a péptidos y expresados en la superficie de la célula tumoral. Teóricamente tienen el mismo potencial como antígeno que las células mutantes.
Antígenos oncofetales
Los antígenos oncofetales son proteínas que son expresadas a altos niveles en células cancerosas y en fetos en desarrollo pero no en tejidos adultos. Se cree que los genes de estas proteínas son silenciados durante el desarrollo fetal y son activados durante las transformaciones malignas.
Antígenos alterados de glucolípidos y glucoproteínas
La mayoría de los tumores experimentales y humanos se expresan en mayor nivel de lo normal o de formas anormales de glucoproteínas y glucolípidos de la superficie celular. Estas moléculas alteradas incluyen gangliósidos y antígenos de grupos sanguíneos. Algunos aspectos del fenotipo maligno, incluyendo la invasión de tejidos y su capacidad de hacer metástasis, pueden reflejar en la superficie de la célula alterada, propiedades que resultan de una síntesis de glucolípidos y glucoproteínas anormales.
Antígenos diferenciales específicos de tejidos
Son llamados antígenos diferenciales los que son específicos a tejidos particulares o etapas de diferenciación de varios tipos de célula. Son agentes considerados como blancos potenciales para inmunoterapia, para la identificación del tejido original de los tumores y se pueden detectar en la superficie celular.
Elementos de la respuesta inmune antitumoral:
Los células inmunes efectoras que contribuyen a una respuesta protectora contra el desarrollo de un tumor pertenecen tanto a la inmunidad innata como a la inmunidad adaptativa o específica.
Varios estudios histopatológicos demostraron que muchos tumores son rodeados por células mononucleares compuestos por linfocitos T, células NK (asesinas naturales) y macrófagos; siendo éstas las principales células efectoras que atacan a las células tumorales.
Respuesta inmune innata:
Células NK
Esta célula asesina tiene la capacidad de diferenciar las células infectadas por un virus, o las células tumorales que han sufrido transformaciones malignas. Esto pasa gracias a que los receptores de membrana de la célula asesina detectan la ausencia de las moléculas de histocompatibilidad en este tipo de células dañadas, y así se activanlas nkpara matar a la célula tumoral. Este sistema sencillo de reconocimiento es muy eficaz. Además de este sistema, liberan interferón gamma y otras citoquinas para desencadenar su respuesta inespecífica y, destruir a la célula que ha presentado dicha sustancia. Al reconocer la célula infectada, se unen a ella y a través de una proteína llamada perforina crean poros en su membrana por los que pasan enzimas llamadas granzimas que inducen la muerte por apoptosis de la célula blanco.
Macrófagos
La función principal de un macrófago es fagocitar, inician una respuesta natural, ya que los macrófagos expresan receptores de membrana; estos en el sistema inmune antitumoral, fagocitan mas eficazmente a las células tumorales que a las normales. Los macrófagos matan a células tumorales probablemente de la misma manera que eliminan a los organismos infecciosos, y activan a otros macrófagos.
Respuesta inmune adaptativa:
Linfocitos T
El principal mecanismo de inmunidad tumoral es matar a las células tumorales mediante los linfocitos T citotóxicos (LTCs), que son LT CD8+. La característica de LTCs para proveer una efectiva respuesta inmune antitumoral in vivo esta visto experimentalmente en animales con carcinógenos inducidos. Los CTLs pueden desempeñar una función de vigilancia, reconociendo y matando células potencialmente malignas que expresen péptidos derivados de una proteína celular mutante o proteínas virales oncogénicas. Son tan específicas en sus funciones letales que son capaces de destruir a la célula blanco sin afectar a las células vecinas no infectadas.
Los moléculas CD8 son glicoproteinas co-receptoras de linfocitos T expresadas en la membrana de los LTCs .
Los glicoproteína CD4+ o son moléculas que se expresa en la superficie de células T colaboradoras. En respuesta a antígenos solubles se induce la proliferación de células T CD4+; estos LTCD4 colaboran en la activación y la diferenciación de las células B en células secretoras de inmunoglobulinas. Participan también en la respuesta inmune antitumoral, proveyendo citoquinas para efectivizar el desarrollo de las LTCs (4 y 8).
La presentación de antígenos estimula a los linfocitos T (células) a convertirse ya sea en"citotóxicos" CD8+ o "colaboradores" CD4+.(4)
Anticuerpos
El huésped que posee un tumor puede producir anticuerpos contra varios antígenos tumorales. Los anticuerpos unidos a los antígenos tumorales expresados en la superficie de la célula tumoral, pueden matar al tumor por la activación del complemento o por citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo a cargo células NK o macrófagos.
Cada anticuerpo se une a su antígeno específico en una interacción similar a la de una llave y una cerradura.(4)
Evasión de los tumores a la respuesta inmune:
Muchos tumores malignos poseen mecanismos que les posibilitan evadir o resistir respuestas inmunes del huésped.
Las células tumorales son derivadas de células huéspedes y pueden confundirse con células normales en muchos aspectos. La mayoría de los tumores expresan solo unos pocos antígenos que pueden ser reconocidos y tienden a producir una respuesta inmunológica. Los tumores que inducen una respuesta inmune fuerte, incluyen los inducidos por virus oncogénicos, en los cuales las proteínas virales son antígenos extraños, y los tumores (inducidos en animales) por carcinógenos, las cuales casi siempre causan mutaciones en genes de la células normales.
El rápido crecimiento y expansión de tumores pueden confundir la capacidad del sistema inmune para eliminar las células tumorales.
Además, muchos tumores tienen mecanismos especializados para evadir las respuestas inmunes contra el huésped:
Los antígenos tumorales pueden inducir una tolerancia inmunológica específica. La tolerancia puede ocurrir porque estos antígenos son considerados como propios por el sistema inmune o porque las células tumorales los presentan de una forma tolerante a los linfocitos.
Los linfocitos T reguladores pueden suprimir las respuestas de linfocitos T contra los tumores. El número de linfocitos T reguladores puede incrementarse en cada paciente y encontrarse como linfocitos inflitrantes dentro del tumor.
Las células tumorales pierden la expresión de los antígenos que estimulan las respuestas inmunes.
Los tumores fallan en la inducción de la activación de los LTCs debido a que muchas células tumorales no expresan moléculas coestimuladoras o moléculas de histocompatibilidad de claseII, impidiendo que la respuesta inmune se propague. Las moléculas coestimuladoras son necesarias para la iniciación de la respuesta inmune de células T y las moléculas de histocompatibilidad de clase II son necesarias para la activación de los LT CD4+ (colaboradores), los cuales son requeridos para la activación de los LTCs para que actúen. Una de las principales moléculas coestimuladoras es la molécula B7.1 o CD80.
Inmunoterapia para tumores
La inmunoterapia tiene como meta lograr la estimulación del sistema inmune y por lo tanto lograr una respuesta delimitada a las células cancerígenas.
Los tratamientos de pacientes con cáncer usando un enfoque inmunológico han originado grandes promesas para la oncología. La principal causa es que las terapias actuales para cáncer se basan en el empleo de drogas o radiaciones que matan a las células o bloquean la división celular, y estos tratamientos tienen severos efectos sobre la proliferación de las células normales. Como resultado, los tratamientos contra el cáncer causan un efecto secundario indeseado que se manifiesta como un malestar importante de los pacientes.
Las vacunas anti-tumorales más tempranas se enfocaron en la inmunización con antígenos tumorales purificados junto con adyuvantes (que son sustancias inflamatorias que por administración local funcionan como activadores de células que participan activando a los linfocitos). En la actualidad se utilizan estrategias más complejas que involucran la inmunización de pacientes con cáncer utilizando células dendríticas purificadas de pacientes transfectadas con plásmidos que poseen genes de antígenos tumorales o incubadas con células tumorales.
Entre las estrategias de inmunoterapia se encuentran:
• Activación no específica del sistema inmune: Con esta modalidad se logra una estimulación inespecífica del sistema inmune. Para esto se han utilizado diferentes elementos inmunoestimulantes. Utiliza bacterias atenuadas como la vacuna BCG (Bacilo Calmette Guerin) o el Corynebacterium parvum y granulosum. Sustancias inflamatorias o adyuvantes: P40, Polyerga, Titermax, etc.
• Activación específica del sistema inmune: Se basa en la inoculación de antígenos tumorales para obtener respuestas inmunes específicas contra el tumor. Si bien en sus inicios se centró la atención en la obtención de vacunas preventivas, en la actualidad se evalúa esta modalidad como arma terapéutica, aceptándose ya el término de vacunas terapéuticas, lo cual se refiere a la inoculación al paciente portador de un tumor maligno, de antígenos presentes en el tumor, en una formulación vacunal que permite incrementar la inmunogenicidad para obtener respuestas inmunes específicas eficientes. Como ejemplo existen las vacunas de células tumorales, vacunas de extractos celulares, vacunas donde se utilizan antígenos tumorales purificados o recombinantes (MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE, MUC-1), vacunas con células dendríticas expresando antígenos tumorales.
• Inmunoterapia Pasiva no específica: Consiste en la administración de elementos del sistema inmune (moléculas o células) procedente de otro organismo, que logran una estimulación inmunológica no antígeno-específica en el portador de un tumor maligno. Por ejemplo células activadas por linfoquinas; citoquinas: IL-2, TNF, IFNα, IFNγ, factores de crecimiento hematopoyéticos.
• Inmunoterapia Pasiva específica: Al igual que en la modalidad anterior se inoculan elementos inmunológicos al organismo portador de un tumor maligno, pero en este caso estos elementos sí reconocen antígenos en las células tumorales, desplegando mecanismos que llevan a su destrucción . Las inmunoterapia pasivas incluyen la transferencia de los efectores inmunes, incluyendo anticuerpos y las células T específicas contra el tumor: Linfocitos infiltrantes de tumores. Inmunotoxinas (anticuerpos monoclonales acoplados a toxinas, radioisótopos, drogas citotóxicas). Anticuerpos anti-idiotípicos. Anticuerpos biespecíficos. Esta terapia contra tumores es rápida pero no perdura por mucho tiempo.
En todas estas modalidades de estimulación la consecuencia final es lograr respuestas inmunes específicas para rechazar a los tumores y no dañar a las células normales.
En la respuesta inmune antitumoral se generan también anticuerpos específicos contra las células neoplásicas. Los anticuerpos monoclonales tumor-específicos pueden ser provechosos para inmunoterapia específica para tumores. Estos pueden erradicar tumores por los mismos mecanismos efectores que son usados para eliminar microbios, incluyendo la fagocitosis y la activación del sistema complementario. Hay actualmente al menos cien diferentes tipos de anticuerpos monoclonales que son empleados, tanto en estudios con animales experimentales o en pacientes, como agentes terapéuticos para cáncer, y algunos han sido aprobados para usos clínicos. Sin embargo las respuestas obtenidas con los anticuerpos no tienen la magnitud de las que se logran con las células citotóxicas. Del estudio de los diferentes mecanismos puestos en marcha, la respuesta inmune por la inducción de células T específicas contra las células cancerígenas es la táctica más eficiente para lograr el rechazo del tumor.
Es por ello que las vacunas contra las neoplasias tienen por objeto primordial la estimulación de células T. Un adelanto trascendente en la inmunología tumoral fue el desarrollo de técnicas para identificar antígenos que son reconocidos por los linfocitos T tumor-específicos CD8+ y CD4+. Los antígenos que son reconocidos en general son péptidos derivados de proteínas normales que han sufrido una mutación o alteración que pueden encontrarse en el citoplasma o expresadas en la superficie de la célula tumoral.
Una estrategia para el aumento de la inmunidad del huésped contra los tumores con moléculas co-estimuladoras de la respuesta inmune y citoquinas.
La inmunidad mediada por células puede ser mejorada por la expresión de moléculas co-estimuladores y citoquinas en las células tumorales que estimulan la proliferación y diferenciación de linfocitos T y células NK. Las células tumorales pueden inducir una respuesta inmune débil porque ellas carecen de moléculas coestimuladores. Dos maneras importantes para impulsar la respuesta del huésped a tumores son proveer artificialmente co-estimulación para células T citoquinas que mejoren la activación de células T especificas, particularmente de CTLs, CD8+.
Modelos de tumores del proyecto:
Este trabajo de investigación utiliza dos modelos tumorales que se desarrollan en ratones de la cepa BALB/c. Ellos son el linfoma murino LBC y el tumor de mama LM3.
Carcinoma de mama LM3
Hace más de 20 años que fue descripto el adenocarcinoma mamario de ratones BALB/c. Desde entonces, este tumor ha sido mantenido mediante pasajes subcutáneos en ratones singeneicos. La línea LM3 fue establecida a partir de cultivos primarios de tumores M3 mediante sucesivos pasajes in vitro. Las monocapas de células LM3 están mayoritariamente (más del 95%) constituidas por células epiteliales poliédricas que son homogéneas en cuanto al tamaño y a la forma del citoplasma y del núcleo. El análisis histopatológico de tumores LM3 en ratones BALB/c inoculados en forma subcutánea han demostrado que estas células generan adenocarcinomas pobremente diferenciados con alta capacidad invasiva, observándose invasión de la dermis y de las capas musculares y adiposas subcutáneas, con células tumorales no polarizadas desprovistas de organización y con escaso estroma entre estas. In vivo, la línea LM3 es capaz de producir metástasis específicamente en pulmón. (1)
Linfoma T, LBC
El tumor denominado LB se originó espontáneamente en un ratón de la cepa BALB/c en el bioterio de la Academia Nacional de Medicina. La línea celular LBC derivada del linfoma LB induce una respuesta inmune humoral y celular débil en ratones singénicos.
Esta línea crece como cultivo en suspención y fue establecida a partir de un linfoma T murino espontáneo de alta agresividad desarrollado en un ratón BALB/c. El análisis por tinción y microscopía óptica mostró que las células presentan una apariencia linfoblastoide de tamaño mediano a grande (menos o igual a 15 μm), núcleo redondeado con nucleolo prominente y ausencia de granos azurofilos. La inoculación por vía intraperitoneal de estas células producen la muerte de los animales en un tiempo medio de 20 días. La simple observación de estos muestra el desarrollo de ascitis evidente a partir de los 12 días post inoculación (2).
En el año 1994 se probó que la transferencia de células LBC transfectadas con genes del complejo mayor de histocompatibilidad ha podido inducir en los ratones una respuesta inmune capaz de rechazar un inoculo grande de células tumorales (un millón) y prolongar el tiempo de sobrevida de estos. En el 2001 se ha llevado a cabo una transfección de esta línea con la molécula coestimuladora CD80, logrando un 39% de células positivas para el marcador del en la población total de células tumorales. Si bien ningún ratón singeneico inmuno-competente inoculado por vía intraperitoneal rechazó el tumor, el tiempo medio de sobrevida de los ratones aumentó en cuatro días con respecto a las células BALB/c sin transfectar. De esta manera las células LBC presentan un modelo de linfoma T espontáneo, poco inmunogénico (hecho que simula la mayoría de los tumores humanos) y que fue extensamente estudiado con sus propiedades inductoras de una respuesta inmune antitumoral.
Objetivos:
El objetivo principal de este proyecto es el desarrollo de vacunas anti-tumorales usando células tumorales genéticamente modificadas y plásmidos que posean genes que codifica para moléculas inmunomoduladores que activen la respuesta inmune del huésped para el rechazo de las neoplasias. Para ello se desarrollaran vacunas empleando plásmidos que poseen genes de las citoquinas IL15 e IL12, que serán utilizados como vectores, o células tumorales transfectadas para expresar las moléculas CD40, CD80 o RANKL. La efectividad se evaluará por su capacidad de controlar el establecimiento de metástasis y/o erradicar una neoplasia establecida.
Objetivos especifícos
• Amplificación y purificación de los plásmidos de interés utilizando el kit “QIAGEN PLASMID MAXI KIT”, que se basa en la lisis alcalina de las bacterias que contienen plásmido y el pasaje por columnas de intercambio iónico.
• Análisis de la pureza de los plásmidos obtenidos por espectrofotometría a 260, 280 y 310 nm.
• Determinación de la concentración de DNA por espectrofotometría a 260 nm.
• Determinación de la identidad del plásmido por digestión con enzimas de restricción y análisis del patrón de restricción en geles de agarosa y la comparación con patrones de peso molecular conocido.
• Determinación de la ausencia de contaminación con DNA geonómico en el gel agarosa.
• Inoculación de células del linfoma murino LBC y del tumor de mama LM3 en ratones singenéicos BALB/c.
• Tratamiento inmunológico de los tumores establecidos por inoculación de los plásmidos en ratones portadores de tumores o por inmunización con las células tumorales transformadas genéticamente.
• Seguimiento de la evolución de los tratamientos por medio de la medición de los tumores sólidos o por el análisis de curvas de sobreviva de los ratones desafiados.
Bibliografía:
1. Luciana Balboa (2007) "Desarrollo de una nueva estrategia de Inmunoterapia Antitumoral utilizando una cepa atenuada de Salmonella typhi como Agente pro-Inflamatorio y Vector para la Transferencia in vivo de Genes de Citoquinas" Tesis de licenciatura de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales de la UBA.
2. Paula Ruybal (2004) "Estudio del Efecto de las Moléculas Coestimuladoras en la Respuesta Inmune Antitumoral" Tesis de Doctorado de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la UBA.
3. Wikipedia: http://es.wikipedia.org/wiki/Sistema_inmunol%C3%B3gico
4. Wikipedia: http://es.wikipedia.org/wiki/Tumor
5. Alejandro J. Urtreger, Virginia E. Ladeda, Lydia I. Puricelli, Alicia Rivelli, Maria Del Carmen Vidal, Eugenia Sacerdote De Lustig y Elisa D. Bal De Kier Joffé. (1997) "Modulation of fibronectin expression and proteolytic activity associated with the invasive and metastatic phenotype in two new murine mammary tumor cell lines" International Journal of Oncology, Vol. II
6. C.Mongini, P. Ruybal, M. J. Gravisaco, M. Croci, M. Sanchez Lockhart, V. Fabris, y C. Waldner. "Characterization of the immunophenotype and the metastatic properties of a murine T-lymphoma cell line. unexpected expression of cytoplasmatic CD4" Society for In Vitro Biology, September 2001.
7. Paula Ruybal, María José Gravisaco, Virna Barcala, Ana Escalada, Paula Di Sciullo, Claudia Waldner, Claudia Mongini (2007) "Complete rejection of a T-cell lymphoma due to synergism of T-cell receptor costimulatory molecules, CD80, CD40l, and CD40" . Vaccine, November 2007
8. Abul K. Abbas, Andrew H. Lichtman y Shiv Pillai (2007) "Cellular and Molecular Inmmunology, 6th edition". Chapter 17 "Immunity to tumors". Editorial Saunders Elsevier.
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