IntroducciónTumor o neoplasiaLos tumores o neoplasias se pueden originar debido a una alteración de células que provoca un aumento en su proliferación de manera descontrolada.
Las neoplasias benignas no son consideradas como cáncer, ya que estas células no se extienden a otras partes del cuerpo, permanecen juntas y a menudo son rodeadas de una membrana de contención o cápsula; generalmente se los puede extirpar y, en la mayoría de los casos, no vuelven a aparecer. Los tumores benignos no constituyen generalmente una amenaza para la vida.
Hay diferentes tipos de tumores benignos, que se clasifican de acuerdo al tejido y al tipo celular de origen:
• papiloma: masa protuberante en la piel (verruga, quiste).
• adenoma: tumor que crece en las glándulas y en torno a las mismas.
• osteoma: tumor de origen en el hueso.
• mioma: tumor del tejido muscular.
En cambio los tumores malignos originan un cáncer. Las células tumorales malignas además de crecer sin control, tienen las propiedades de invadir y destruir órganos de alrededor, y pueden entrar en el sistema linfático o en el flujo sanguíneo, que es la manera como alcanzan otras partes del cuerpo. Esta propagación del tumor en sitios lejanos se denomina metástasis. Generalmente, los tumores se dividen en tres categorías de acuerdo a su origen:
• carcinomas: estos cánceres se originan en el epitelio, que es el tejido que recubre de las células de un órgano. Los carcinomas constituyen el tipo más común de cáncer. Los lugares comunes de carcinomas son la piel, la boca, el pulmón, los senos, el estómago, el colon y el útero.
• sarcomas: Los sarcomas son canceres del tejido conectivo y de sostén (tejidos blandos) de todos los tipos. Los sarcomas se encuentran en cualquier parte del cuerpo y frecuentemente forman crecimientos secundarios o metástasis en los pulmones.
• teratoma inmaduro: estos tumores cancerosos poco frecuentes se asemejan a tejidos embrionarios o fetales.(3)
Antígenos tumorales:Cuando las células tumorales expresan antigenos que no expresan las células normales, el sistema inmunológico reconoce a estos como extraños y causa que las células que lo componen, ataquen a estas células tumorales transformadas.
La primera demostración experimental de que los tumores pueden inducir la respuesta inmune protectora proviene de estudios de transplantes de tumores hechos en 1950. Un sarcoma fue inducido en un ratón pintando su piel con un químico cancerígeno (metil colantreno). Los resultados del experimento demostraron que si el tumor inducido es extirpado y transplantado en otros ratones singeneicos (que poseen los mismos antígenos de histocompatibilidad que los de la célula cancerosa) el tumor crece. En cambio, si el tumor es transplantado nuevamente en el hospedador original que se ha vuelto inmune a éste, el ratón rechaza el tumor, pero es incapaz de rechazar el tumor inducido producido por los otros ratones. Además, los linfocitos T obtenidos del ratón portador del sarcoma pueden transmitir una inmunidad protectora contra el tumor cuando son transferidos a un animal normal libre de tumor. Por lo tanto, las respuestas inmunes a tumores exhiben las principales características de la respuesta inmunológica adaptativa, específidad y memoria, y son mediadas por linfocitos. Pero frecuentemente el sistema inmune responde mal al crecimiento de tumores y no erradica las células transformadas.
Una variedad de antígenos tumorales que puede ser reconocidas por linfocitos T y B han sido identificados en cánceres de humanos y de animales. Estos inducen una respuesta inmune adaptativa.
La primera clasificación de antígenos tumorales fue basada en sus formas de expresión. Los antígenos que se expresan en células tumorales pero no en células normales son llamados antígenos específicos del tumor. Quitar lo que decía aquí en el texto original. Aquellos que son también expresados en células normales son llamados antígenos asociados al tumor (son constituyentes de células normales cuya expresión es desregularizada o aberrante en tumores). La clasificación moderna de antígenos tumorales se basa en la estructura molecular y el origen de estos.
Antígenos de virus oncogénicosEl producto de virus oncogénicos son antígenos tumorales inductores de una respuesta específica de células T. Los virus de ADN o ARN (retrovirus) están implicados en varios tumores en humanos y animales experimentales. En la mayoría de los tumores inducidos por ADN virus se encuentran las proteínas antigénicas del virus en el núcleo, el citoplasma, o en la membrana plasmática de las células tumorales. Estas proteínas sintetizadas en forma endógena, dentro de la célula, pueden ser procesadas, degradas a péptidos y expresados en la superficie de la célula tumoral. Teóricamente tienen el mismo potencial como antígeno que las células mutantes.
Antígenos oncofetalesLos antígenos oncofetales son proteínas que son expresadas a altos niveles en células cancerosas y en fetos en desarrollo pero no en tejidos adultos. Se cree que los genes de estas proteínas son silenciados durante el desarrollo fetal y son activados durante las transformaciones malignas.
Antígenos alterados de glucolípidos y glucoproteínas La mayoría de los tumores experimentales y humanos se expresan en mayor nivel de lo normal o de formas anormales de glucoproteínas y glucolípidos de la superficie celular. Estas moléculas alteradas incluyen gangliósidos y antígenos de grupos sanguíneos. Algunos aspectos del fenotipo maligno, incluyendo la invasión de tejidos y su capacidad de hacer metástasis, pueden reflejar en la superficie de la célula alterada, propiedades que resultan de una síntesis de glucolípidos y glucoproteínas anormales.
Antígenos diferenciales específicos de tejidos
Son llamados antígenos diferenciales los que son específicos a tejidos particulares o etapas de diferenciación de varios tipos de célula. Son agentes considerados como blancos potenciales para inmunoterapia, para la identificación del tejido original de los tumores y se pueden detectar en la superficie celular.
Elementos de la respuesta inmune antitumoral:
Los células inmunes efectoras que contribuyen a una respuesta protectora contra el desarrollo de un tumor pertenecen tanto a la inmunidad innata como a la inmunidad adaptativa o específica.
Varios estudios histopatológicos demostraron que muchos tumores son rodeados por células mononucleares compuestos por linfocitos T, células NK (asesinas naturales) y macrófagos; siendo éstas las principales células efectoras que atacan a las células tumorales.
Respuesta inmune innata:
Células NK
Esta célula asesina tiene la capacidad de diferenciar las células infectadas por un
virus, o las células
tumorales que han sufrido transformaciones malignas. Esto pasa gracias a que los receptores de membrana de la célula asesina detectan la ausencia de las
moléculas de histocompatibilidad en este tipo de células dañadas, y así se activanlas nkpara matar a la célula tumoral. Este sistema sencillo de reconocimiento es muy eficaz. Además de este sistema, liberan
interferón gamma y otras citoquinas para desencadenar su respuesta inespecífica y, destruir a la célula que ha presentado dicha sustancia. Al reconocer la célula infectada, se unen a ella y a través de una proteína llamada perforina crean poros en su membrana por los que pasan enzimas llamadas granzimas que inducen la muerte por apoptosis de la célula blanco.
MacrófagosLa función principal de un macrófago es fagocitar, inician una respuesta natural, ya que los macrófagos expresan
receptores de membrana; estos en el sistema inmune antitumoral, fagocitan mas eficazmente a las células tumorales que a las normales. Los macrófagos matan a células tumorales probablemente de la misma manera que eliminan a los organismos infecciosos, y activan a otros macrófagos.
Respuesta inmune adaptativa:
Linfocitos TEl principal mecanismo de inmunidad tumoral es matar a las células tumorales mediante los linfocitos T citotóxicos (LTCs), que son LT CD8+. La característica de LTCs para proveer una efectiva respuesta inmune antitumoral in vivo esta visto experimentalmente en animales con carcinógenos inducidos. Los CTLs pueden desempeñar una función de vigilancia, reconociendo y matando células potencialmente malignas que expresen péptidos derivados de una proteína celular mutante o proteínas virales oncogénicas. Son tan específicas en sus funciones letales que son capaces de destruir a la célula blanco sin afectar a las células vecinas no infectadas.
Los moléculas CD8 son glicoproteinas co-receptoras de linfocitos T expresadas en la membrana de los LTCs .
Los glicoproteína CD4+ o son
moléculas que se expresa en la superficie de
células T colaboradoras. En respuesta a
antígenos solubles se induce la proliferación de
células T CD4+; estos LTCD4 colaboran en la activación y la diferenciación de las
células B en células secretoras de
inmunoglobulinas. Participan también en la respuesta inmune antitumoral, proveyendo citoquinas para efectivizar el desarrollo de las LTCs (4 y 8).
La presentación de antígenos estimula a los linfocitos T (células) a convertirse ya sea en"citotóxicos" CD8+ o "colaboradores" CD4+.(4)
AnticuerposEl huésped que posee un tumor puede producir anticuerpos contra varios antígenos tumorales. Los anticuerpos unidos a los antígenos tumorales expresados en la superficie de la célula tumoral, pueden matar al tumor por la activación del complemento o por citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo a cargo células NK o macrófagos.
Cada anticuerpo se une a su antígeno específico en una interacción similar a la de una llave y una cerradura.(4)
Evasión de los tumores a la respuesta inmune:Muchos tumores malignos poseen mecanismos que les posibilitan evadir o resistir respuestas inmunes del huésped.
Las células tumorales son derivadas de células huéspedes y pueden confundirse con células normales en muchos aspectos. La mayoría de los tumores expresan solo unos pocos antígenos que pueden ser reconocidos y tienden a producir una respuesta inmunológica. Los tumores que inducen una respuesta inmune fuerte, incluyen los inducidos por virus oncogénicos, en los cuales las proteínas virales son antígenos extraños, y los tumores (inducidos en animales) por carcinógenos, las cuales casi siempre causan mutaciones en genes de la células normales.
El rápido crecimiento y expansión de tumores pueden confundir la capacidad del sistema inmune para eliminar las células tumorales.
Además, muchos tumores tienen mecanismos especializados para evadir las respuestas inmunes contra el huésped:
Los antígenos tumorales pueden inducir una tolerancia inmunológica específica. La tolerancia puede ocurrir porque estos antígenos son considerados como propios por el sistema inmune o porque las células tumorales los presentan de una forma tolerante a los linfocitos.
Los linfocitos T reguladores pueden suprimir las respuestas de linfocitos T contra los tumores. El número de linfocitos T reguladores puede incrementarse en cada paciente y encontrarse como linfocitos inflitrantes dentro del tumor.
Las células tumorales pierden la expresión de los antígenos que estimulan las respuestas inmunes.
Los tumores fallan en la inducción de la activación de los LTCs debido a que muchas células tumorales no expresan moléculas coestimuladoras o moléculas de histocompatibilidad de claseII, impidiendo que la respuesta inmune se propague. Las moléculas coestimuladoras son necesarias para la iniciación de la respuesta inmune de células T y las moléculas de histocompatibilidad de clase II son necesarias para la activación de los LT CD4+ (colaboradores), los cuales son requeridos para la activación de los LTCs para que actúen. Una de las principales moléculas coestimuladoras es la molécula B7.1 o CD80.
Inmunoterapia para tumoresLa inmunoterapia tiene como meta lograr la estimulación del sistema inmune y por lo tanto lograr una respuesta delimitada a las células cancerígenas.
Los tratamientos de pacientes con cáncer usando un enfoque inmunológico han originado grandes promesas para la oncología. La principal causa es que las terapias actuales para cáncer se basan en el empleo de drogas o radiaciones que matan a las células o bloquean la división celular, y estos tratamientos tienen severos efectos sobre la proliferación de las células normales. Como resultado, los tratamientos contra el cáncer causan un efecto secundario indeseado que se manifiesta como un malestar importante de los pacientes.
Las vacunas anti-tumorales más tempranas se enfocaron en la inmunización con antígenos tumorales purificados junto con adyuvantes (que son sustancias inflamatorias que por administración local funcionan como activadores de células que participan activando a los linfocitos). En la actualidad se utilizan estrategias más complejas que involucran la inmunización de pacientes con cáncer utilizando células dendríticas purificadas de pacientes transfectadas con plásmidos que poseen genes de antígenos tumorales o incubadas con células tumorales.
Entre las estrategias de inmunoterapia se encuentran:
•
Activación no específica del sistema inmune: Con esta modalidad se logra una estimulación inespecífica del sistema inmune. Para esto se han utilizado diferentes elementos inmunoestimulantes. Utiliza bacterias atenuadas como la vacuna BCG (Bacilo Calmette Guerin) o el Corynebacterium parvum y granulosum. Sustancias inflamatorias o adyuvantes: P40, Polyerga, Titermax, etc.
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Activación específica del sistema inmune: Se basa en la inoculación de antígenos tumorales para obtener respuestas inmunes específicas contra el tumor. Si bien en sus inicios se centró la atención en la obtención de vacunas preventivas, en la actualidad se evalúa esta modalidad como arma terapéutica, aceptándose ya el término de vacunas terapéuticas, lo cual se refiere a la inoculación al paciente portador de un tumor maligno, de antígenos presentes en el tumor, en una formulación vacunal que permite incrementar la inmunogenicidad para obtener respuestas inmunes específicas eficientes. Como ejemplo existen las vacunas de células tumorales, vacunas de extractos celulares, vacunas donde se utilizan antígenos tumorales purificados o recombinantes (MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE, MUC-1), vacunas con células dendríticas expresando antígenos tumorales.
•
Inmunoterapia Pasiva no específica: Consiste en la administración de elementos del sistema inmune (moléculas o células) procedente de otro organismo, que logran una estimulación inmunológica no antígeno-específica en el portador de un tumor maligno. Por ejemplo células activadas por linfoquinas; citoquinas: IL-2, TNF, IFNα, IFNγ, factores de crecimiento hematopoyéticos.
•
Inmunoterapia Pasiva específica: Al igual que en la modalidad anterior se inoculan elementos inmunológicos al organismo portador de un tumor maligno, pero en este caso estos elementos sí reconocen antígenos en las células tumorales, desplegando mecanismos que llevan a su destrucción . Las inmunoterapia pasivas incluyen la transferencia de los efectores inmunes, incluyendo anticuerpos y las células T específicas contra el tumor: Linfocitos infiltrantes de tumores. Inmunotoxinas (anticuerpos monoclonales acoplados a toxinas, radioisótopos, drogas citotóxicas). Anticuerpos anti-idiotípicos. Anticuerpos biespecíficos. Esta terapia contra tumores es rápida pero no perdura por mucho tiempo.
En todas estas modalidades de estimulación la consecuencia final es lograr respuestas inmunes específicas para rechazar a los tumores y no dañar a las células normales.
En la respuesta inmune antitumoral se generan también anticuerpos específicos contra las células neoplásicas. Los anticuerpos monoclonales tumor-específicos pueden ser provechosos para inmunoterapia específica para tumores. Estos pueden erradicar tumores por los mismos mecanismos efectores que son usados para eliminar microbios, incluyendo la fagocitosis y la activación del sistema complementario. Hay actualmente al menos cien diferentes tipos de anticuerpos monoclonales que son empleados, tanto en estudios con animales experimentales o en pacientes, como agentes terapéuticos para cáncer, y algunos han sido aprobados para usos clínicos. Sin embargo las respuestas obtenidas con los anticuerpos no tienen la magnitud de las que se logran con las células citotóxicas. Del estudio de los diferentes mecanismos puestos en marcha, la respuesta inmune por la inducción de células T específicas contra las células cancerígenas es la táctica más eficiente para lograr el rechazo del tumor.
Es por ello que las vacunas contra las neoplasias tienen por objeto primordial la estimulación de células T. Un adelanto trascendente en la inmunología tumoral fue el desarrollo de técnicas para identificar antígenos que son reconocidos por los linfocitos T tumor-específicos CD8+ y CD4+. Los antígenos que son reconocidos en general son péptidos derivados de proteínas normales que han sufrido una mutación o alteración que pueden encontrarse en el citoplasma o expresadas en la superficie de la célula tumoral.
Una estrategia para el aumento de la inmunidad del huésped contra los tumores con moléculas co-estimuladoras de la respuesta inmune y citoquinas.
La inmunidad mediada por células puede ser mejorada por la expresión de moléculas co-estimuladores y citoquinas en las células tumorales que estimulan la proliferación y diferenciación de linfocitos T y células NK. Las células tumorales pueden inducir una respuesta inmune débil porque ellas carecen de moléculas coestimuladores. Dos maneras importantes para impulsar la respuesta del huésped a tumores son proveer artificialmente co-estimulación para células T citoquinas que mejoren la activación de células T especificas, particularmente de CTLs, CD8+.
Modelos de tumores del proyecto:
Este trabajo de investigación utiliza dos modelos tumorales que se desarrollan en ratones de la cepa BALB/c. Ellos son el linfoma murino LBC y el tumor de mama LM3.
Carcinoma de mama LM3
Hace más de 20 años que fue descripto el adenocarcinoma mamario de ratones BALB/c. Desde entonces, este tumor ha sido mantenido mediante pasajes subcutáneos en ratones singeneicos. La línea LM3 fue establecida a partir de cultivos primarios de tumores M3 mediante sucesivos pasajes in vitro. Las monocapas de células LM3 están mayoritariamente (más del 95%) constituidas por células epiteliales poliédricas que son homogéneas en cuanto al tamaño y a la forma del citoplasma y del núcleo. El análisis histopatológico de tumores LM3 en ratones BALB/c inoculados en forma subcutánea han demostrado que estas células generan adenocarcinomas pobremente diferenciados con alta capacidad invasiva, observándose invasión de la dermis y de las capas musculares y adiposas subcutáneas, con células tumorales no polarizadas desprovistas de organización y con escaso estroma entre estas. In vivo, la línea LM3 es capaz de producir metástasis específicamente en pulmón. (1)
Linfoma T, LBC
El tumor denominado LB se originó espontáneamente en un ratón de la cepa BALB/c en el bioterio de la Academia Nacional de Medicina. La línea celular LBC derivada del linfoma LB induce una respuesta inmune humoral y celular débil en ratones singénicos.
Esta línea crece como cultivo en suspención y fue establecida a partir de un linfoma T murino espontáneo de alta agresividad desarrollado en un ratón BALB/c. El análisis por tinción y microscopía óptica mostró que las células presentan una apariencia linfoblastoide de tamaño mediano a grande (menos o igual a 15 μm), núcleo redondeado con nucleolo prominente y ausencia de granos azurofilos. La inoculación por vía intraperitoneal de estas células producen la muerte de los animales en un tiempo medio de 20 días. La simple observación de estos muestra el desarrollo de ascitis evidente a partir de los 12 días post inoculación (2).
En el año 1994 se probó que la transferencia de células LBC transfectadas con genes del complejo mayor de histocompatibilidad ha podido inducir en los ratones una respuesta inmune capaz de rechazar un inoculo grande de células tumorales (un millón) y prolongar el tiempo de sobrevida de estos. En el 2001 se ha llevado a cabo una transfección de esta línea con la molécula coestimuladora CD80, logrando un 39% de células positivas para el marcador del en la población total de células tumorales. Si bien ningún ratón singeneico inmuno-competente inoculado por vía intraperitoneal rechazó el tumor, el tiempo medio de sobrevida de los ratones aumentó en cuatro días con respecto a las células BALB/c sin transfectar. De esta manera las células LBC presentan un modelo de linfoma T espontáneo, poco inmunogénico (hecho que simula la mayoría de los tumores humanos) y que fue extensamente estudiado con sus propiedades inductoras de una respuesta inmune antitumoral.
Objetivos:El objetivo principal de este proyecto es el desarrollo de vacunas anti-tumorales usando células tumorales genéticamente modificadas y plásmidos que posean genes que codifica para moléculas inmunomoduladores que activen la respuesta inmune del huésped para el rechazo de las neoplasias. Para ello se desarrollaran vacunas empleando plásmidos que poseen genes de las citoquinas IL15 e IL12, que serán utilizados como vectores, o células tumorales transfectadas para expresar las moléculas CD40, CD80 o RANKL. La efectividad se evaluará por su capacidad de controlar el establecimiento de metástasis y/o erradicar una neoplasia establecida.
Objetivos especifícos• Amplificación y purificación de los plásmidos de interés utilizando el kit “QIAGEN PLASMID MAXI KIT”, que se basa en la lisis alcalina de las bacterias que contienen plásmido y el pasaje por columnas de intercambio iónico.
• Análisis de la pureza de los plásmidos obtenidos por espectrofotometría a 260, 280 y 310 nm.
• Determinación de la concentración de DNA por espectrofotometría a 260 nm.
• Determinación de la identidad del plásmido por digestión con enzimas de restricción y análisis del patrón de restricción en geles de agarosa y la comparación con patrones de peso molecular conocido.
• Determinación de la ausencia de contaminación con DNA geonómico en el gel agarosa.
• Inoculación de células del linfoma murino LBC y del tumor de mama LM3 en ratones singenéicos BALB/c.
• Tratamiento inmunológico de los tumores establecidos por inoculación de los plásmidos en ratones portadores de tumores o por inmunización con las células tumorales transformadas genéticamente.
• Seguimiento de la evolución de los tratamientos por medio de la medición de los tumores sólidos o por el análisis de curvas de sobreviva de los ratones desafiados.
Bibliografía:
1. Luciana Balboa (2007) "Desarrollo de una nueva estrategia de Inmunoterapia Antitumoral utilizando una cepa atenuada de Salmonella typhi como Agente pro-Inflamatorio y Vector para la Transferencia in vivo de Genes de Citoquinas" Tesis de licenciatura de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales de la UBA.
2. Paula Ruybal (2004) "Estudio del Efecto de las Moléculas Coestimuladoras en la Respuesta Inmune Antitumoral" Tesis de Doctorado de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la UBA.
3. Wikipedia: http://es.wikipedia.org/wiki/Sistema_inmunol%C3%B3gico
4. Wikipedia: http://es.wikipedia.org/wiki/Tumor
5. Alejandro J. Urtreger, Virginia E. Ladeda, Lydia I. Puricelli, Alicia Rivelli, Maria Del Carmen Vidal, Eugenia Sacerdote De Lustig y Elisa D. Bal De Kier Joffé. (1997) "Modulation of fibronectin expression and proteolytic activity associated with the invasive and metastatic phenotype in two new murine mammary tumor cell lines" International Journal of Oncology, Vol. II
6. C.Mongini, P. Ruybal, M. J. Gravisaco, M. Croci, M. Sanchez Lockhart, V. Fabris, y C. Waldner. "Characterization of the immunophenotype and the metastatic properties of a murine T-lymphoma cell line. unexpected expression of cytoplasmatic CD4" Society for In Vitro Biology, September 2001.
7. Paula Ruybal, María José Gravisaco, Virna Barcala, Ana Escalada, Paula Di Sciullo, Claudia Waldner, Claudia Mongini (2007) "Complete rejection of a T-cell lymphoma due to synergism of T-cell receptor costimulatory molecules, CD80, CD40l, and CD40" . Vaccine, November 2007
8. Abul K. Abbas, Andrew H. Lichtman y Shiv Pillai (2007) "Cellular and Molecular Inmmunology, 6th edition". Chapter 17 "Immunity to tumors". Editorial Saunders Elsevier.
