Luego hicimos la curva de crecimiento tumoral, en cm3 en función de días (tomando el promedio de los volúmenes de todos los ratones en un día, como el volumen promedio en un día y tomando como primer día el día que fue inducido el tumor).
25 de septiembre
Monitoreamos el crecimiento del tumor en distintos grupos de ratones. El tamaño lo tomamos como el volumen (midiendo los tres diámetros: ancho, largo y profundidad). Las jaulas eran las B200 VT A: bacteria CVD intratumoral y periganglinar + CVD intranasal, B: bacteria TY intratumoral y periganglinar + TY intranasal, C: bacteria CVD intratumoral y periganglinar + PBS intranasal, D: bacteria TY intratumoral y periganglinar + PBS intranasal, E(control): PBS intranasal + PBS intratumoral y periganglinar; y el grupo 326 A: plasmido subcutaneo IL12 + IL15 50microg por animal + PBS intranasal, B: plasmido IL12 + IL15 50microg por animal intranasal + PBS subcutaneo, C: PBS intranasal + PBS subcutaneo. (Se puede hacer en todos los casos en vez de subcutaneo, de forma intratumoral).
Luego hicimos la curva de crecimiento tumoral, en cm3 en función de días (tomando el promedio de los volúmenes de todos los ratones en un día, como el volumen promedio en un día y tomando como primer día el día que fue inducido el tumor).
Luego hicimos la curva de crecimiento tumoral, en cm3 en función de días (tomando el promedio de los volúmenes de todos los ratones en un día, como el volumen promedio en un día y tomando como primer día el día que fue inducido el tumor).
18 de Septiembre
Hoy preparamos a las células LM3 para poder inocular.
Para esto realizamos los siguientes pasos:
1. Miramos a las células Lm3 por el microscopio (estas crecen en monocapa)
2. Lavamos dos veces con PBS para sacar el medio (que tiene células muertas y desperdicios)
3. Agregamos tripsina que tiene una enzima peptidasa (rompe la monocapa separando a las células LM3)
4.Se lleva a la estufa por 5´a 37ºC para que las enzimas se activen.
5. Mirar las LM3 por el microscopio, si no están separadas, golpear las paredes del envase suavemente.
6. Colocarlas en el medio MEM (2 % glutamina, 1% penincilina y estreptomisina, o.5 %gentamisina)
7.Centrifugamos 8´a 16ºC a 82G.
8. Luego de centrifugar tiramos el sobrenadante y volvemos a llenar con medio MEM.
9. Volvemos a centrifugar.
10. Tirar el sobrenadante y agregar 1 ml de medio MEM; tomamos una alícuota y contar la cantidad de células (previamente teñidas con trip-blue) por el microscopio.
11. Inoculas a cada ratón con 200 microlitros de las células en medio MEM, de forma subcutánea.
Para esto realizamos los siguientes pasos:
1. Miramos a las células Lm3 por el microscopio (estas crecen en monocapa)
2. Lavamos dos veces con PBS para sacar el medio (que tiene células muertas y desperdicios)
3. Agregamos tripsina que tiene una enzima peptidasa (rompe la monocapa separando a las células LM3)
4.Se lleva a la estufa por 5´a 37ºC para que las enzimas se activen.
5. Mirar las LM3 por el microscopio, si no están separadas, golpear las paredes del envase suavemente.
6. Colocarlas en el medio MEM (2 % glutamina, 1% penincilina y estreptomisina, o.5 %gentamisina)
7.Centrifugamos 8´a 16ºC a 82G.
8. Luego de centrifugar tiramos el sobrenadante y volvemos a llenar con medio MEM.
9. Volvemos a centrifugar.
10. Tirar el sobrenadante y agregar 1 ml de medio MEM; tomamos una alícuota y contar la cantidad de células (previamente teñidas con trip-blue) por el microscopio.
11. Inoculas a cada ratón con 200 microlitros de las células en medio MEM, de forma subcutánea.
4 de Septiembre
Hicimos un repaso sobre las líneas LBC y la LM3 hasta llegar al ratón. El LBC crece en suspension, por lo que se debe centrifugar para que las células queden abajo. Tiramos el medio, y volvemos a centrifuga (hasta que queden solo las celulas) se lava con PBS; luego de esto esta listo para inocular directamente (medir la concentracion).
La línea LM3 crece en monocapa y luego se le debe poner tripsina ya que rompe el enlace de células y levanta la monocapa, dejándolas en suspension. Pero como las proteínas del suero que tiene el medio donde esta la LM3 la inactiva, se debe lavar el suero. Luego se procede de la misma manera que con la línea LBC y se inocula en ratones singenéicos de la cepa BALB/c.
También repasamos la respuesta inmunologica de histocompatibilidad y sobre los tipos de linfocitos, que son células presentadoras de antígenos lo que ayuda a desarrollar una respuesta. Pueden ser linfocitos T"helpers"1, donde se encuentras los linfocitos T citotóxicos, que pueden ser coestimuladores (que la falta de una proteína los estimule), eliminan células con afecciones en su interior; y pueden ser linfocitos Th2 que estimulan a los linfocitos B, que son anticuerpos que eliminan patógenos en sangre.
Luego aprendimos sobre las citoquinas, que tienen que estar en cierto balance en el cuerpo, ya que inhiben respuestas inmunológicas.
Por último, hablamos de los plásmidos como tratamiento a tumores. Estos tienen un injerto y un promotor (CMV) para que se replique, lo que hace que cuando lo inoculemos, la célula lo incorpore en el núcleo y por compatibilidad de bases se unan, y una vez que la célula exprese la proteína libere la sintetizada.
Luego de todo esto, fuimos al bioterio (donde estan los ratones a experimentar).
Aprendimos como agarrarlos de manera de inmovilizarlos sin lastimarlos. Y, en grupos con tratamientos previos, aplicamos una tercera dosis de sustancias y controles. Como queremos que todos esten en iguales condiciones para un posterior analizamiento eficiente, se les debe poner a todos lo que pueda alterar la reaccion.
Los tres grupos que trataremos ya tienen el tumor inducido y crecido. Estan con células LM3. Utilizaremos en su tratamiento citoquinas PIL-12 y PIL-15 (en menos concentración en el caso de la inhalación). El primer grupo lo monitoreamos (medimos con calibre el tamaño del tumor para luego hacer una curva de crecimiento tumoral), le dimos plásmido internasal y PBS (placebo). El segundo grupo lo monitoreamos, le pusimos el plásmido intratumoral y PBS. Y al tercer grupo solo PBS.
La línea LM3 crece en monocapa y luego se le debe poner tripsina ya que rompe el enlace de células y levanta la monocapa, dejándolas en suspension. Pero como las proteínas del suero que tiene el medio donde esta la LM3 la inactiva, se debe lavar el suero. Luego se procede de la misma manera que con la línea LBC y se inocula en ratones singenéicos de la cepa BALB/c.
También repasamos la respuesta inmunologica de histocompatibilidad y sobre los tipos de linfocitos, que son células presentadoras de antígenos lo que ayuda a desarrollar una respuesta. Pueden ser linfocitos T"helpers"1, donde se encuentras los linfocitos T citotóxicos, que pueden ser coestimuladores (que la falta de una proteína los estimule), eliminan células con afecciones en su interior; y pueden ser linfocitos Th2 que estimulan a los linfocitos B, que son anticuerpos que eliminan patógenos en sangre.
Luego aprendimos sobre las citoquinas, que tienen que estar en cierto balance en el cuerpo, ya que inhiben respuestas inmunológicas.
Por último, hablamos de los plásmidos como tratamiento a tumores. Estos tienen un injerto y un promotor (CMV) para que se replique, lo que hace que cuando lo inoculemos, la célula lo incorpore en el núcleo y por compatibilidad de bases se unan, y una vez que la célula exprese la proteína libere la sintetizada.
Luego de todo esto, fuimos al bioterio (donde estan los ratones a experimentar).
Aprendimos como agarrarlos de manera de inmovilizarlos sin lastimarlos. Y, en grupos con tratamientos previos, aplicamos una tercera dosis de sustancias y controles. Como queremos que todos esten en iguales condiciones para un posterior analizamiento eficiente, se les debe poner a todos lo que pueda alterar la reaccion.
Los tres grupos que trataremos ya tienen el tumor inducido y crecido. Estan con células LM3. Utilizaremos en su tratamiento citoquinas PIL-12 y PIL-15 (en menos concentración en el caso de la inhalación). El primer grupo lo monitoreamos (medimos con calibre el tamaño del tumor para luego hacer una curva de crecimiento tumoral), le dimos plásmido internasal y PBS (placebo). El segundo grupo lo monitoreamos, le pusimos el plásmido intratumoral y PBS. Y al tercer grupo solo PBS.
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