Continuamos con el protocolo para la purificacion de plasmidos. (solo para CD40)
Resuspendemos las bacterias con el buffer P1 (con RNAsa). Luego le aplicamos el buffers P2 y mezclamos cuidadosamente, esperamos 5 minutos y ponemos el siguiente buffer(P3). Lo dejamos reposar por 20 minutos en frio.
Después lo centrifugamos por 30 minutos a 4ºC. Removemos el sobrenadante y lo ponemos en un recipiente nuevo y centrifugamos por 15 minutos a la misma temperatura.
Mientras tanto limpiamos la columna con el buffer renew y la equilibramos con el buffer QBT. colocamos el sobrenadante en la columna y lo dejamos correr. Después de vaciarse la columna agregamos el buffer QC y por ultimo el buffer QF, este arrastra el plasmido por ende lo guardamos.
Para precipitar el DNA lo diluimos en isopropanol y centrifugamos. Dejamos decantar y lavamos el pellet con etanol 70%. Guardamos el DNA en el freezer para poder continuar en la próxima clase.
17 Julio
Comenzamos nuevamente el protocolo, pero con CD40, ya que como se puede apreciar en la foto del 10 de Julio, en el corrimiento de ADN no figuro, por ende, perdimos el ADN en algún paso del protocolo, y hay que realizarlo nuevamente.
Centrifugamos las bacterias y las guardamos en el freezer hasta su próximo uso.
Centrifugamos las bacterias y las guardamos en el freezer hasta su próximo uso.
10 de Julio
Continuamos con el ultimo paso de este protocolo, que es cuantificar el análisis en el gel agarosa.
Pero para esto se deben hacer previamente diluciones del DNA resultante tanto de CD40 como de CD80 (aunque en CD40 no fueron los resultados esperados, se debe hacer igual para descartar alguna posibilidad de que haya ADN). El corrimiento de ADN sirve para comparar el ADN nuestro con un Marker, y según su corrimiento y donde coincida, se saca la concentración. Además se puede comprobar que no haya ARN o alguna otra sustancia que no se quiera, en otras palabras, es una forma de verificar si hicimos bien el protocolo y el ADN esta puro.
Las diluciones fueron las siguientes, mediante cálculos que dependian de la concentración de ADN de CD40 y CD80, pusimos las correctas cantidades de enzima digestiva y Tris-Cl. Centrifugamos y templamos donde pusimos enzima digestiva.
Nos quedaron un total de 5 ependorf:
1)Tris-Cl+CD80
2)Enzima digestiva+Tris-Cl+CD80
3)Marker (el corrimiento "guia" para comparar)+Tris-Cl
4)CD40+Tris-Cl
5)Enzima digestiva+CD40+Tris-Cl
Luego procedimos a hacer el corrimiento de ADN, con mucho cuidado (guantes, como toda la experiencia), pero especial cuidado aquí de no tocar nada porque el bromuro de etilo es cancerigeno. Inoculamos el ADN en el gel y esperamos dos horas a que se corra (recordar que el Gel estaba ya solidificado de la clase anterior). Luego de este tiempo, pudimos observar el corrimiento, consiste en que el DNA al ser negativo, vaya al polo positivo. Y le sacamos una foto que luego usaremos para averiguar la concentración, comparando como dijimos antes, con el Marker.
Pero para esto se deben hacer previamente diluciones del DNA resultante tanto de CD40 como de CD80 (aunque en CD40 no fueron los resultados esperados, se debe hacer igual para descartar alguna posibilidad de que haya ADN). El corrimiento de ADN sirve para comparar el ADN nuestro con un Marker, y según su corrimiento y donde coincida, se saca la concentración. Además se puede comprobar que no haya ARN o alguna otra sustancia que no se quiera, en otras palabras, es una forma de verificar si hicimos bien el protocolo y el ADN esta puro.
Las diluciones fueron las siguientes, mediante cálculos que dependian de la concentración de ADN de CD40 y CD80, pusimos las correctas cantidades de enzima digestiva y Tris-Cl. Centrifugamos y templamos donde pusimos enzima digestiva.
Nos quedaron un total de 5 ependorf:
1)Tris-Cl+CD80
2)Enzima digestiva+Tris-Cl+CD80
3)Marker (el corrimiento "guia" para comparar)+Tris-Cl
4)CD40+Tris-Cl
5)Enzima digestiva+CD40+Tris-Cl
Luego procedimos a hacer el corrimiento de ADN, con mucho cuidado (guantes, como toda la experiencia), pero especial cuidado aquí de no tocar nada porque el bromuro de etilo es cancerigeno. Inoculamos el ADN en el gel y esperamos dos horas a que se corra (recordar que el Gel estaba ya solidificado de la clase anterior). Luego de este tiempo, pudimos observar el corrimiento, consiste en que el DNA al ser negativo, vaya al polo positivo. Y le sacamos una foto que luego usaremos para averiguar la concentración, comparando como dijimos antes, con el Marker.
3 de Julio
Sacamos el DNA del freezer y quitamos el sobrenadante rápidamente, para que el DNA no se pierda. (Esta casi invisible)
Disolvimos el DNA en un adecuado volumen de buffer Tris-Cl. Luego, para determinar el rendimiento y la concentración den DNA usamos el espectofotometro UV.
Hicimos cálculos para saber cuanto teníamos de cada uno, tanto en la CD80 como en la CD40, lamentablemente en esta ultima el resultado no fue lo esperado y casi no se detecto ADN (lo habremos perdido en alguno de los pasos anteriores al protocolo).
Por ultimo, hicimos el gel agarosa para el corrimiento de ADN con mucho cuidado, ya que los materiales que se utilizan para este procedimiento son cancerosos. Y lo continuaremos la clase siguiente.
Disolvimos el DNA en un adecuado volumen de buffer Tris-Cl. Luego, para determinar el rendimiento y la concentración den DNA usamos el espectofotometro UV.
Hicimos cálculos para saber cuanto teníamos de cada uno, tanto en la CD80 como en la CD40, lamentablemente en esta ultima el resultado no fue lo esperado y casi no se detecto ADN (lo habremos perdido en alguno de los pasos anteriores al protocolo).
Por ultimo, hicimos el gel agarosa para el corrimiento de ADN con mucho cuidado, ya que los materiales que se utilizan para este procedimiento son cancerosos. Y lo continuaremos la clase siguiente.
26 de junio
Hoy continuamos con el protocolo para la purificacion de plasmidos.
Resuspendimos el pellet en un buffer adecuado (P1) con la RNAsa, después agregamos otro bufferP2 y lo mezclamos. Por ultimo, después de esperar 5 minuto, agregamos el ultimo buffer P3 y esperamos 20 minutos en frió. (el buffer P1 "saca" al ARN, el buffer P2 destruye la membrna de las bacterias, por esto no es comveniente que pase los cinco minutos porque puede destruir al plasmido).
Después lo centrifugamos (30 minutos a 4ºC) y removemos el sobrenadante(que es el plasmido). Repetimos la centrifugación pero por 15 minutos.
Limpiamos la columnas que vamos a usar con el buffer renew y las equilibramos con el buffer QBT. Colocamos el sobrenadanten la columna y luego de vaciarse, quedan plasmidos, proteinas y otros materiales.
Limpiamos los restos de proteínas con buffer QC, para dejar el plasmido en la columna y luego le ponemos el buffer QF, que arrastra al plamisdo, el cual se guarda en un recipiente.
Resuspendimos el pellet en un buffer adecuado (P1) con la RNAsa, después agregamos otro bufferP2 y lo mezclamos. Por ultimo, después de esperar 5 minuto, agregamos el ultimo buffer P3 y esperamos 20 minutos en frió. (el buffer P1 "saca" al ARN, el buffer P2 destruye la membrna de las bacterias, por esto no es comveniente que pase los cinco minutos porque puede destruir al plasmido).
Después lo centrifugamos (30 minutos a 4ºC) y removemos el sobrenadante(que es el plasmido). Repetimos la centrifugación pero por 15 minutos.
Limpiamos la columnas que vamos a usar con el buffer renew y las equilibramos con el buffer QBT. Colocamos el sobrenadanten la columna y luego de vaciarse, quedan plasmidos, proteinas y otros materiales.
Limpiamos los restos de proteínas con buffer QC, para dejar el plasmido en la columna y luego le ponemos el buffer QF, que arrastra al plamisdo, el cual se guarda en un recipiente.
Para precipitar el DNA lo diluimos en isopropanol, mezclamos y centrifugamos inmediatamente por 30 min. a 4 grados. Y dejamos decantar cuidadosamente.
Luego lavamos el pellet con etanol 70% templado, y lo dejamos decantar. Guardamos el DNA en el freezer y continuamos en la próxima clase.
19 de junio
Hoy comenzamos el protocolo para purificación de plasmidos.
Partiendo de una sola colonia, la incubamos en el medio LB (con antibióticos) durante 8 horas a 37ºC . Para seguir multiplicando las colonias, y poder tener una mayor copia de plasmidos, realizamos una dilución 1/1000 y lo inoculamos en 100ml del medio( a 37ºC durante 12-16 horas con agitación vigorosa).
Después lo centifugamos en a 6000 rpm por 15 minutos por 4 ºC, luego de esta centrifugación las bacterias se quedaron abajo, entonces procedemos a quitar el medio de cultivo. En este paso nos detuvimos ya que podemos congelar las células, sin ningún problema, (a -20ºC) y continuar la semana siguiente.
Partiendo de una sola colonia, la incubamos en el medio LB (con antibióticos) durante 8 horas a 37ºC . Para seguir multiplicando las colonias, y poder tener una mayor copia de plasmidos, realizamos una dilución 1/1000 y lo inoculamos en 100ml del medio( a 37ºC durante 12-16 horas con agitación vigorosa).
Después lo centifugamos en a 6000 rpm por 15 minutos por 4 ºC, luego de esta centrifugación las bacterias se quedaron abajo, entonces procedemos a quitar el medio de cultivo. En este paso nos detuvimos ya que podemos congelar las células, sin ningún problema, (a -20ºC) y continuar la semana siguiente.
12 de Junio
Hoy ajustamos el PH en las soluciones buffer que vamos a utilizar para nuestros experimentos.
Estas son Buffer QBT, Buffer P1, Buffer QC, Buffer QF , Buffer P3 y BufferP2. Las controlamos mediante un peachimetro que media el PH en cada solución buffer.
En el caso de que tuviera un PH mas alcalino de lo debido, se colocaba HCL para bajar el PH; y, en el caso de que tuviera un PH mas ácido de lo debido, se colocaba NAOH para subir el PH. La considerabamos ajustada a su PH cuando tenia el mínimo o nada de error en su medición buffer.
Luego llevamos los envases al autoclave para esterilizar.
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