Comenzamos nuevamente el protocolo, pero con CD40, ya que como se puede apreciar en la foto del 10 de Julio, en el corrimiento de ADN no figuro, por ende, perdimos el ADN en algún paso del protocolo, y hay que realizarlo nuevamente.
Centrifugamos las bacterias y las guardamos en el freezer hasta su próximo uso.
10 de Julio
Continuamos con el ultimo paso de este protocolo, que es cuantificar el análisis en el gel agarosa.
Pero para esto se deben hacer previamente diluciones del DNA resultante tanto de CD40 como de CD80 (aunque en CD40 no fueron los resultados esperados, se debe hacer igual para descartar alguna posibilidad de que haya ADN). El corrimiento de ADN sirve para comparar el ADN nuestro con un Marker, y según su corrimiento y donde coincida, se saca la concentración. Además se puede comprobar que no haya ARN o alguna otra sustancia que no se quiera, en otras palabras, es una forma de verificar si hicimos bien el protocolo y el ADN esta puro.
Las diluciones fueron las siguientes, mediante cálculos que dependian de la concentración de ADN de CD40 y CD80, pusimos las correctas cantidades de enzima digestiva y Tris-Cl. Centrifugamos y templamos donde pusimos enzima digestiva.
Nos quedaron un total de 5 ependorf:
1)Tris-Cl+CD80
2)Enzima digestiva+Tris-Cl+CD80
3)Marker (el corrimiento "guia" para comparar)+Tris-Cl
4)CD40+Tris-Cl
5)Enzima digestiva+CD40+Tris-Cl
Luego procedimos a hacer el corrimiento de ADN, con mucho cuidado (guantes, como toda la experiencia), pero especial cuidado aquí de no tocar nada porque el bromuro de etilo es cancerigeno. Inoculamos el ADN en el gel y esperamos dos horas a que se corra (recordar que el Gel estaba ya solidificado de la clase anterior). Luego de este tiempo, pudimos observar el corrimiento, consiste en que el DNA al ser negativo, vaya al polo positivo. Y le sacamos una foto que luego usaremos para averiguar la concentración, comparando como dijimos antes, con el Marker.
Pero para esto se deben hacer previamente diluciones del DNA resultante tanto de CD40 como de CD80 (aunque en CD40 no fueron los resultados esperados, se debe hacer igual para descartar alguna posibilidad de que haya ADN). El corrimiento de ADN sirve para comparar el ADN nuestro con un Marker, y según su corrimiento y donde coincida, se saca la concentración. Además se puede comprobar que no haya ARN o alguna otra sustancia que no se quiera, en otras palabras, es una forma de verificar si hicimos bien el protocolo y el ADN esta puro.
Las diluciones fueron las siguientes, mediante cálculos que dependian de la concentración de ADN de CD40 y CD80, pusimos las correctas cantidades de enzima digestiva y Tris-Cl. Centrifugamos y templamos donde pusimos enzima digestiva.
Nos quedaron un total de 5 ependorf:
1)Tris-Cl+CD80
2)Enzima digestiva+Tris-Cl+CD80
3)Marker (el corrimiento "guia" para comparar)+Tris-Cl
4)CD40+Tris-Cl
5)Enzima digestiva+CD40+Tris-Cl
Luego procedimos a hacer el corrimiento de ADN, con mucho cuidado (guantes, como toda la experiencia), pero especial cuidado aquí de no tocar nada porque el bromuro de etilo es cancerigeno. Inoculamos el ADN en el gel y esperamos dos horas a que se corra (recordar que el Gel estaba ya solidificado de la clase anterior). Luego de este tiempo, pudimos observar el corrimiento, consiste en que el DNA al ser negativo, vaya al polo positivo. Y le sacamos una foto que luego usaremos para averiguar la concentración, comparando como dijimos antes, con el Marker.
3 de Julio
Sacamos el DNA del freezer y quitamos el sobrenadante rápidamente, para que el DNA no se pierda. (Esta casi invisible)
Disolvimos el DNA en un adecuado volumen de buffer Tris-Cl. Luego, para determinar el rendimiento y la concentración den DNA usamos el espectofotometro UV.
Hicimos cálculos para saber cuanto teníamos de cada uno, tanto en la CD80 como en la CD40, lamentablemente en esta ultima el resultado no fue lo esperado y casi no se detecto ADN (lo habremos perdido en alguno de los pasos anteriores al protocolo).
Por ultimo, hicimos el gel agarosa para el corrimiento de ADN con mucho cuidado, ya que los materiales que se utilizan para este procedimiento son cancerosos. Y lo continuaremos la clase siguiente.
Disolvimos el DNA en un adecuado volumen de buffer Tris-Cl. Luego, para determinar el rendimiento y la concentración den DNA usamos el espectofotometro UV.
Hicimos cálculos para saber cuanto teníamos de cada uno, tanto en la CD80 como en la CD40, lamentablemente en esta ultima el resultado no fue lo esperado y casi no se detecto ADN (lo habremos perdido en alguno de los pasos anteriores al protocolo).
Por ultimo, hicimos el gel agarosa para el corrimiento de ADN con mucho cuidado, ya que los materiales que se utilizan para este procedimiento son cancerosos. Y lo continuaremos la clase siguiente.
Suscribirse a:
Entradas (Atom)