26 de junio

Hoy continuamos con el protocolo para la purificacion de plasmidos.

Resuspendimos el pellet en un buffer adecuado (P1) con la RNAsa, después agregamos otro bufferP2 y lo mezclamos. Por ultimo, después de esperar 5 minuto, agregamos el ultimo buffer P3 y esperamos 20 minutos en frió. (el buffer P1 "saca" al ARN, el buffer P2 destruye la membrna de las bacterias, por esto no es comveniente que pase los cinco minutos porque puede destruir al plasmido).

Después lo centrifugamos (30 minutos a 4ºC) y removemos el sobrenadante(que es el plasmido). Repetimos la centrifugación pero por 15 minutos.

Limpiamos la columnas que vamos a usar con el buffer renew y las equilibramos con el buffer QBT. Colocamos el sobrenadanten la columna y luego de vaciarse, quedan plasmidos, proteinas y otros materiales.
Limpiamos los restos de proteínas con buffer QC, para dejar el plasmido en la columna y luego le ponemos el buffer QF, que arrastra al plamisdo, el cual se guarda en un recipiente.

Para precipitar el DNA lo diluimos en isopropanol, mezclamos y centrifugamos inmediatamente por 30 min. a 4 grados. Y dejamos decantar cuidadosamente.

Luego lavamos el pellet con etanol 70% templado, y lo dejamos decantar. Guardamos el DNA en el freezer y continuamos en la próxima clase.

19 de junio

Hoy comenzamos el protocolo para purificación de plasmidos.

Partiendo de una sola colonia, la incubamos en el medio LB (con antibióticos) durante 8 horas a 37ºC . Para seguir multiplicando las colonias, y poder tener una mayor copia de plasmidos, realizamos una dilución 1/1000 y lo inoculamos en 100ml del medio( a 37ºC durante 12-16 horas con agitación vigorosa).

Después lo centifugamos en a 6000 rpm por 15 minutos por 4 ºC, luego de esta centrifugación las bacterias se quedaron abajo, entonces procedemos a quitar el medio de cultivo. En este paso nos detuvimos ya que podemos congelar las células, sin ningún problema, (a -20ºC) y continuar la semana siguiente.

12 de Junio

Hoy ajustamos el PH en las soluciones buffer que vamos a utilizar para nuestros experimentos.

Estas son Buffer QBT, Buffer P1, Buffer QC, Buffer QF , Buffer P3 y BufferP2. Las controlamos mediante un peachimetro que media el PH en cada solución buffer.

En el caso de que tuviera un PH mas alcalino de lo debido, se colocaba HCL para bajar el PH; y, en el caso de que tuviera un PH mas ácido de lo debido, se colocaba NAOH para subir el PH. La considerabamos ajustada a su PH cuando tenia el mínimo o nada de error en su medición buffer.

Luego llevamos los envases al autoclave para esterilizar.

5 de Junio

Aprendimos como replicar el ADN. Esto sirve para evaluar la habilidad de una misma colonia para crecer bajo diferentes condiciones. Estas son transferidas de una placa a otra para mantener las células originales. El plásmido que vamos a utilizar es ampicilina resistente, de manera que le colocaremos este antibiótico para eliminar las bacterias que son sensibles a este y, de esta manera, aislar el plásmido a utilizar.
Hicimos el caldo enriquecido LB, el cual vamos a utilizar para el cultivo de nuestras bacterias.




Este, contiene triptona, extracto de levadura y Cloruro de Sodio.

Para esterilizar tapamos la boca con un tapon de algodon y aluminio. Y, junto con cajas de tips (envueltas en aluminio y papel madera), los llevamos al autoclave.