10 de Julio

Continuamos con el ultimo paso de este protocolo, que es cuantificar el análisis en el gel agarosa.
Pero para esto se deben hacer previamente diluciones del DNA resultante tanto de CD40 como de CD80 (aunque en CD40 no fueron los resultados esperados, se debe hacer igual para descartar alguna posibilidad de que haya ADN). El corrimiento de ADN sirve para comparar el ADN nuestro con un Marker, y según su corrimiento y donde coincida, se saca la concentración. Además se puede comprobar que no haya ARN o alguna otra sustancia que no se quiera, en otras palabras, es una forma de verificar si hicimos bien el protocolo y el ADN esta puro.

Las diluciones fueron las siguientes, mediante cálculos que dependian de la concentración de ADN de CD40 y CD80, pusimos las correctas cantidades de enzima digestiva y Tris-Cl. Centrifugamos y templamos donde pusimos enzima digestiva.
Nos quedaron un total de 5 ependorf:
1)Tris-Cl+CD80
2)Enzima digestiva+Tris-Cl+CD80
3)Marker (el corrimiento "guia" para comparar)+Tris-Cl
4)CD40+Tris-Cl
5)Enzima digestiva+CD40+Tris-Cl

Luego procedimos a hacer el corrimiento de ADN, con mucho cuidado (guantes, como toda la experiencia), pero especial cuidado aquí de no tocar nada porque el bromuro de etilo es cancerigeno. Inoculamos el ADN en el gel y esperamos dos horas a que se corra (recordar que el Gel estaba ya solidificado de la clase anterior). Luego de este tiempo, pudimos observar el corrimiento, consiste en que el DNA al ser negativo, vaya al polo positivo. Y le sacamos una foto que luego usaremos para averiguar la concentración, comparando como dijimos antes, con el Marker.

3 de Julio

Sacamos el DNA del freezer y quitamos el sobrenadante rápidamente, para que el DNA no se pierda. (Esta casi invisible)

Disolvimos el DNA en un adecuado volumen de buffer Tris-Cl. Luego, para determinar el rendimiento y la concentración den DNA usamos el espectofotometro UV.

Hicimos cálculos para saber cuanto teníamos de cada uno, tanto en la CD80 como en la CD40, lamentablemente en esta ultima el resultado no fue lo esperado y casi no se detecto ADN (lo habremos perdido en alguno de los pasos anteriores al protocolo).

Por ultimo, hicimos el gel agarosa para el corrimiento de ADN con mucho cuidado, ya que los materiales que se utilizan para este procedimiento son cancerosos. Y lo continuaremos la clase siguiente.

26 de junio

Hoy continuamos con el protocolo para la purificacion de plasmidos.

Resuspendimos el pellet en un buffer adecuado (P1) con la RNAsa, después agregamos otro bufferP2 y lo mezclamos. Por ultimo, después de esperar 5 minuto, agregamos el ultimo buffer P3 y esperamos 20 minutos en frió. (el buffer P1 "saca" al ARN, el buffer P2 destruye la membrna de las bacterias, por esto no es comveniente que pase los cinco minutos porque puede destruir al plasmido).

Después lo centrifugamos (30 minutos a 4ºC) y removemos el sobrenadante(que es el plasmido). Repetimos la centrifugación pero por 15 minutos.

Limpiamos la columnas que vamos a usar con el buffer renew y las equilibramos con el buffer QBT. Colocamos el sobrenadanten la columna y luego de vaciarse, quedan plasmidos, proteinas y otros materiales.
Limpiamos los restos de proteínas con buffer QC, para dejar el plasmido en la columna y luego le ponemos el buffer QF, que arrastra al plamisdo, el cual se guarda en un recipiente.

Para precipitar el DNA lo diluimos en isopropanol, mezclamos y centrifugamos inmediatamente por 30 min. a 4 grados. Y dejamos decantar cuidadosamente.

Luego lavamos el pellet con etanol 70% templado, y lo dejamos decantar. Guardamos el DNA en el freezer y continuamos en la próxima clase.

19 de junio

Hoy comenzamos el protocolo para purificación de plasmidos.

Partiendo de una sola colonia, la incubamos en el medio LB (con antibióticos) durante 8 horas a 37ºC . Para seguir multiplicando las colonias, y poder tener una mayor copia de plasmidos, realizamos una dilución 1/1000 y lo inoculamos en 100ml del medio( a 37ºC durante 12-16 horas con agitación vigorosa).

Después lo centifugamos en a 6000 rpm por 15 minutos por 4 ºC, luego de esta centrifugación las bacterias se quedaron abajo, entonces procedemos a quitar el medio de cultivo. En este paso nos detuvimos ya que podemos congelar las células, sin ningún problema, (a -20ºC) y continuar la semana siguiente.

12 de Junio

Hoy ajustamos el PH en las soluciones buffer que vamos a utilizar para nuestros experimentos.

Estas son Buffer QBT, Buffer P1, Buffer QC, Buffer QF , Buffer P3 y BufferP2. Las controlamos mediante un peachimetro que media el PH en cada solución buffer.

En el caso de que tuviera un PH mas alcalino de lo debido, se colocaba HCL para bajar el PH; y, en el caso de que tuviera un PH mas ácido de lo debido, se colocaba NAOH para subir el PH. La considerabamos ajustada a su PH cuando tenia el mínimo o nada de error en su medición buffer.

Luego llevamos los envases al autoclave para esterilizar.

5 de Junio

Aprendimos como replicar el ADN. Esto sirve para evaluar la habilidad de una misma colonia para crecer bajo diferentes condiciones. Estas son transferidas de una placa a otra para mantener las células originales. El plásmido que vamos a utilizar es ampicilina resistente, de manera que le colocaremos este antibiótico para eliminar las bacterias que son sensibles a este y, de esta manera, aislar el plásmido a utilizar.
Hicimos el caldo enriquecido LB, el cual vamos a utilizar para el cultivo de nuestras bacterias.




Este, contiene triptona, extracto de levadura y Cloruro de Sodio.

Para esterilizar tapamos la boca con un tapon de algodon y aluminio. Y, junto con cajas de tips (envueltas en aluminio y papel madera), los llevamos al autoclave.

29 de Mayo

Analizamos como se procesan los datos estadísticos en la curva de muerte. A partir de un dato control se utilizan distintos métodos experimentales para revertir el cancer y se evalúa la evolución en dicho gráfico (cuál es la más efectiva, la que detiene o disminuye la muerte de ratones, por ende la mas propicia para seguir estudiándola. Siempre probado con un número mínimo de ratones).

También presenciamos una cirugía para inyectarle células de tumor LM3 al ratón: la veterinaria lo anestesió, le sacó el bazo y se inyectó en la arteria las células para que haga directamente metástasis y se desarrolle el tumor en el hígado. Luego de esperar tres minutos, se extirpa el bazo y se cose con hilo de sutura desinfectando con Pervinox.



Por último hablamos de los tumores, que se considera cualquier alteración en los tejidos que produzca un aumento de volumen anormal, haciéndolo parecer hinchado o distendido. En otras palabras, cualquier bulto que se deba a un aumento en el número de células de forma incontrolada que lo componen.
Hay dos formas de tumores generales: los benignos y los malignos.
Los tumores benignos o neoplasias tiene células que se asemejan a las células originales y permanecen juntas y a menudo son rodeadas por una membrana de contención o cápsula. Tienen un crecimiento lento que puede interrumpirse o retroceder y no produce metástasis. Por lo general no ocasiona la muerte y no es cancerosa, pueden removerse o extirparse y no tienden a reaparecer.
Los tumores malignos tienen células capaces de crecer rápidamente, de manera descontrolada, ininterrumpible e independiente del tejido donde comenzó, y no retrocede. Además son capaces invadir o infiltrar, destruir, reemplazar y hacer metástasis a lugares distantes del tumor primario, dañando tejidos y órganos cercanos al tumor. Se consideran células cancerosas, no se asemejan a las células maduras originales y pueden ocasionar la muerte si no se diagnostica y suministra tratamiento.