26 de junio

Hoy continuamos con el protocolo para la purificacion de plasmidos.

Resuspendimos el pellet en un buffer adecuado (P1) con la RNAsa, después agregamos otro bufferP2 y lo mezclamos. Por ultimo, después de esperar 5 minuto, agregamos el ultimo buffer P3 y esperamos 20 minutos en frió. (el buffer P1 "saca" al ARN, el buffer P2 destruye la membrna de las bacterias, por esto no es comveniente que pase los cinco minutos porque puede destruir al plasmido).

Después lo centrifugamos (30 minutos a 4ºC) y removemos el sobrenadante(que es el plasmido). Repetimos la centrifugación pero por 15 minutos.

Limpiamos la columnas que vamos a usar con el buffer renew y las equilibramos con el buffer QBT. Colocamos el sobrenadanten la columna y luego de vaciarse, quedan plasmidos, proteinas y otros materiales.
Limpiamos los restos de proteínas con buffer QC, para dejar el plasmido en la columna y luego le ponemos el buffer QF, que arrastra al plamisdo, el cual se guarda en un recipiente.

Para precipitar el DNA lo diluimos en isopropanol, mezclamos y centrifugamos inmediatamente por 30 min. a 4 grados. Y dejamos decantar cuidadosamente.

Luego lavamos el pellet con etanol 70% templado, y lo dejamos decantar. Guardamos el DNA en el freezer y continuamos en la próxima clase.

19 de junio

Hoy comenzamos el protocolo para purificación de plasmidos.

Partiendo de una sola colonia, la incubamos en el medio LB (con antibióticos) durante 8 horas a 37ºC . Para seguir multiplicando las colonias, y poder tener una mayor copia de plasmidos, realizamos una dilución 1/1000 y lo inoculamos en 100ml del medio( a 37ºC durante 12-16 horas con agitación vigorosa).

Después lo centifugamos en a 6000 rpm por 15 minutos por 4 ºC, luego de esta centrifugación las bacterias se quedaron abajo, entonces procedemos a quitar el medio de cultivo. En este paso nos detuvimos ya que podemos congelar las células, sin ningún problema, (a -20ºC) y continuar la semana siguiente.

12 de Junio

Hoy ajustamos el PH en las soluciones buffer que vamos a utilizar para nuestros experimentos.

Estas son Buffer QBT, Buffer P1, Buffer QC, Buffer QF , Buffer P3 y BufferP2. Las controlamos mediante un peachimetro que media el PH en cada solución buffer.

En el caso de que tuviera un PH mas alcalino de lo debido, se colocaba HCL para bajar el PH; y, en el caso de que tuviera un PH mas ácido de lo debido, se colocaba NAOH para subir el PH. La considerabamos ajustada a su PH cuando tenia el mínimo o nada de error en su medición buffer.

Luego llevamos los envases al autoclave para esterilizar.

5 de Junio

Aprendimos como replicar el ADN. Esto sirve para evaluar la habilidad de una misma colonia para crecer bajo diferentes condiciones. Estas son transferidas de una placa a otra para mantener las células originales. El plásmido que vamos a utilizar es ampicilina resistente, de manera que le colocaremos este antibiótico para eliminar las bacterias que son sensibles a este y, de esta manera, aislar el plásmido a utilizar.
Hicimos el caldo enriquecido LB, el cual vamos a utilizar para el cultivo de nuestras bacterias.




Este, contiene triptona, extracto de levadura y Cloruro de Sodio.

Para esterilizar tapamos la boca con un tapon de algodon y aluminio. Y, junto con cajas de tips (envueltas en aluminio y papel madera), los llevamos al autoclave.

29 de Mayo

Analizamos como se procesan los datos estadísticos en la curva de muerte. A partir de un dato control se utilizan distintos métodos experimentales para revertir el cancer y se evalúa la evolución en dicho gráfico (cuál es la más efectiva, la que detiene o disminuye la muerte de ratones, por ende la mas propicia para seguir estudiándola. Siempre probado con un número mínimo de ratones).

También presenciamos una cirugía para inyectarle células de tumor LM3 al ratón: la veterinaria lo anestesió, le sacó el bazo y se inyectó en la arteria las células para que haga directamente metástasis y se desarrolle el tumor en el hígado. Luego de esperar tres minutos, se extirpa el bazo y se cose con hilo de sutura desinfectando con Pervinox.



Por último hablamos de los tumores, que se considera cualquier alteración en los tejidos que produzca un aumento de volumen anormal, haciéndolo parecer hinchado o distendido. En otras palabras, cualquier bulto que se deba a un aumento en el número de células de forma incontrolada que lo componen.
Hay dos formas de tumores generales: los benignos y los malignos.
Los tumores benignos o neoplasias tiene células que se asemejan a las células originales y permanecen juntas y a menudo son rodeadas por una membrana de contención o cápsula. Tienen un crecimiento lento que puede interrumpirse o retroceder y no produce metástasis. Por lo general no ocasiona la muerte y no es cancerosa, pueden removerse o extirparse y no tienden a reaparecer.
Los tumores malignos tienen células capaces de crecer rápidamente, de manera descontrolada, ininterrumpible e independiente del tejido donde comenzó, y no retrocede. Además son capaces invadir o infiltrar, destruir, reemplazar y hacer metástasis a lugares distantes del tumor primario, dañando tejidos y órganos cercanos al tumor. Se consideran células cancerosas, no se asemejan a las células maduras originales y pueden ocasionar la muerte si no se diagnostica y suministra tratamiento.

22 de Mayo

Palpamos los dos tipos de tumores(LBC y LM3) en ratones BALB/c. Aprendimos la forma en que se tratan con diferentes tipos de inmunoterapias.
Estudiamos la curva de muerte, que monitorea la evolución del tumor a través del fallecimientos de los ratones por día, entre el grupo de control (tienen el tumor) y el experimental (tienen el tumor y están en tratamiento).
Nos explicaron de donde se obtienen los tumores LM3 y LBC. Estos provienen un cultivo primario que se expandió in vitro, para tener una linea de estos.
Se inoculan los ratones de manera intraperitonial (atravesando en peritoneo), subcutánea (más superficial) e intravenosa.
Nos anticiparon el tiempo de latencia (cuanto demora un tumor en ser palpable) y de vida estimados (cuanto resiste un ratón al tumor)
Por último vimos a las células del tumor LBC en microscopio óptico.













En esta foto se puede obsevar ascitis (acumulacion de liquido en el abdomen) provocado por el tumor LBC.












Esta foto muestra el tumor LM3.

15 de mayo

Nos mostraron las instalaciones en donde vamos a trabajar y algunos de los elementos de trabajo.
Tuvimos una clase teórica sobre el sistema inmunologico,conjunto de mecanismos que protegen al organismo de infecciones por medio de la identificación y eliminación de agentes patógenos al huésped: como bacterias, virus y tumores.
Como reacciona este: puede ser en forma espontánea e innata, como barreras físicas que evitan que los agentes patógenos como las bacterias y los virus penetren en el organismo. Esto es inmediato pero no especifico. Y el adaptativo, adapta su respuesta durante la infección para mejorar el reconocimiento del agente patógeno; también produce una respuesta inducida, que la provee las vacunas, el suero.
La mayor parte del sistema inmunologico esta formado por glóbulos blancos, que actúan como organismos unicelulares independientes. Estos contienen: fagocitos (macrófagos, neutrófilos y células dendríticas), mastocitos,linfocitos, eosinófilos, basófilos y células asesinas naturales.
El mecanismo de destrucción empieza por atacar a el antígeno con neutrófilos, que degradan y liberan sustancias que llaman a las otras células de los glóbulos blancos. En conjunto se encargan de fagocitar (comen, desarman y presentan la proteína en la membrana de la célula invadida).Los linfocitos B sintetizan los anticuerpos y se desencadena una serie de mecanismos que hace que la bacteria se destruya. Los linfocitos T colaboran sintetizando citoquinas, ayudando a la especificidad de los anticuerpos. Y los citotóxicos reconocen las células presentadoras de antígenos.
Los tumores que vamos a ver son el linfoma LBC y el carcinoma de mama, LM3. En esta clase nos enfocamos en el estudio del linfoma LBC que se induce en ratones de la cepa BALB/c; y los pasos a seguir para innocularles el tumor y probar diferentes tratamientos, para evauluar las respuestas de estos a ellos.